Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A pulmonalis cisztás fibrózis kezelésére szolgáló génvektorokat a vezetőképes légutakra kell célozni, mivel a perifériás tüdőtranszdukciónak nincs terápiás hatása.A vírustranszdukció hatékonysága közvetlenül összefügg a hordozó tartózkodási idejével.A szállítófolyadékok, például a génhordozók azonban belélegzés közben természetesen diffundálnak az alveolusokba, és bármilyen alakú terápiás részecskék gyorsan eltávolíthatók a mukociliáris transzport révén.A génhordozók légúti tartózkodási idejének meghosszabbítása fontos, de nehezen megvalósítható.A légutak felszínére irányítható, hordozóhoz konjugált mágneses részecskék javíthatják a regionális célzást.Az in vivo képalkotással kapcsolatos problémák miatt az ilyen kis mágneses részecskék viselkedése a légutak felületén alkalmazott mágneses tér jelenlétében kevéssé ismert.Ennek a tanulmánynak a célja az volt, hogy szinkrotron képalkotást alkalmazzunk egy sor mágneses részecskék mozgásának in vivo vizualizálására érzéstelenített patkányok légcsőjében, hogy tanulmányozzuk az egyedi és tömeges részecskék dinamikáját és viselkedési mintáit in vivo.Ezután azt is megvizsgáltuk, hogy a lentivírus mágneses részecskék mágneses tér jelenlétében történő szállítása növelné-e a transzdukció hatékonyságát a patkány légcsőben.A szinkrotron röntgen képalkotás a mágneses részecskék viselkedését mutatja álló és mozgó mágneses térben in vitro és in vivo.A részecskéket nem lehet könnyen áthúzni az élő légutak felületén mágnesekkel, de szállítás közben a lerakódások a látómezőben koncentrálódnak, ahol a legerősebb a mágneses tér.A transzdukció hatékonysága hatszorosára nőtt, amikor a lentivírus mágneses részecskéket mágneses tér jelenlétében szállították.Összességében ezek az eredmények azt sugallják, hogy a lentivírus mágneses részecskék és mágneses mezők értékes megközelítések lehetnek a génvektor-célzás és a transzdukciós szint javítására a vezető légutakban in vivo.
A cisztás fibrózist (CF) egyetlen gén, a CF transzmembrán vezetőképesség szabályozó (CFTR) variációi okozzák.A CFTR fehérje egy ioncsatorna, amely számos hámsejtben jelen van a szervezetben, beleértve a légutakat is, amely a cisztás fibrózis patogenezisének egyik fő helye.A CFTR hibái abnormális vízszállításhoz, a légutak felszínének kiszáradásához és a légúti felszíni folyadékréteg (ASL) mélységének csökkenéséhez vezetnek.Ezenkívül rontja a mukociliáris transzport (MCT) rendszer azon képességét, hogy megtisztítsa a légutakat a belélegzett részecskéktől és kórokozóktól.Célunk egy lentivírus (LV) génterápia kifejlesztése a CFTR gén megfelelő másolatának bejuttatására, valamint az ASL, MCT és a tüdő egészségének javítására, valamint olyan új technológiák fejlesztése, amelyek in vivo mérni tudják ezeket a paramétereket1.
Az LV vektorok a cisztás fibrózis génterápia egyik vezető jelöltjei, főként azért, mert tartósan képesek integrálni a terápiás gént a légúti bazális sejtekbe (légúti őssejtekbe).Ez azért fontos, mert helyreállíthatják a normál hidratációt és a nyálkakiürülést azáltal, hogy funkcionális, génkorrigált légúti felszíni sejtté differenciálódnak, amelyek a cisztás fibrózishoz társulnak, ami élethosszig tartó előnyökkel jár.Az LV vektorokat a vezető légutak ellen kell irányítani, mivel itt kezdődik a tüdő érintettsége a CF-ben.A vektor tüdő mélyebbre jutása alveoláris transzdukciót eredményezhet, de ennek nincs terápiás hatása cisztás fibrózisban.Azonban a folyadékok, mint például a génhordozók, természetesen bevándorolnak az alveolusokba, amikor belélegzik a szülés után3,4, és a terápiás részecskéket az MCT-k gyorsan kiürítik a szájüregbe.A bal kamrai transzdukció hatékonysága közvetlenül összefügg azzal az időtartammal, ameddig a vektor a célsejtek közelében marad, hogy lehetővé tegye a sejtfelvételt – a „tartózkodási idő” 5, amelyet a tipikus regionális légáramlás, valamint a nyálka- és MCT-részecskék összehangolt felvétele könnyen lerövidít.A cisztás fibrózis esetében az LV tartózkodási idejének meghosszabbítása a légutakban fontos a transzdukció magas szintjének eléréséhez ezen a területen, de ez eddig kihívást jelentett.
Ennek az akadálynak a leküzdése érdekében azt javasoljuk, hogy az LV mágneses részecskék (MP-k) két egymást kiegészítő módon segíthetnek.Először is, egy mágnes irányíthatja őket a légutak felületére, hogy javítsa a célzást, és segítse a génhordozó részecskéket, hogy a légút megfelelő területére kerüljenek;és ASL) a sejtrétegbe költöznek. statikus elektromosság jelenléte.Mágneses mezők a rákterápiához 7. Más „hipertermikus” módszerek célja a tumorsejtek elpusztítása azáltal, hogy rezgő mágneses mezőknek vannak kitéve MP-ek melegítésével.A mágneses transzfekció elvét, amelyben mágneses mezőt használnak transzfekciós ágensként a DNS sejtekbe történő átvitelének elősegítésére, általában in vitro alkalmazzák, számos nem vírusos és virális génvektort alkalmazva nehezen transzdukálható sejtvonalakhoz. ..Megállapították az LV-mágneses transzfekció hatékonyságát az LV MP in vitro bejuttatásával a humán hörgőhám sejtvonalába, statikus mágneses tér jelenlétében, ami 186-szorosára növeli a transzdukció hatékonyságát az egyedüli LV vektorhoz képest.Az LV MT-t a cisztás fibrózis in vitro modelljére is alkalmazták, ahol a mágneses transzfekció 20-szorosára növelte az LV transzdukciót levegő-folyadék határfelületi kultúrákban cisztás fibrózis köpet jelenlétében10.Az in vivo szervi magnetotranszfekció azonban viszonylag kevés figyelmet kapott, és csak néhány állatkísérletben értékelték11,12,13,14,15, különösen a tüdőben16,17.A mágneses transzfekció lehetőségei azonban a cisztás fibrózis tüdőterápiájában egyértelműek.Tan és mtsai.(2020) kijelentette, hogy „a mágneses nanorészecskék hatékony pulmonális bejuttatásáról szóló validációs tanulmány megnyitja az utat a jövőbeni CFTR inhalációs stratégiák előtt, amelyek javítják a cisztás fibrózisban szenvedő betegek klinikai kimenetelét”6.
A légutak felületén lévő kis mágneses részecskék viselkedését alkalmazott mágneses tér jelenlétében nehéz elképzelni és tanulmányozni, ezért ezek kevéssé ismertek.Más tanulmányokban kifejlesztettünk egy szinkrotron terjedés alapú fáziskontraszt röntgen képalkotási (PB-PCXI) módszert nem invazív képalkotásra és az ASL18 mélységben és az MCT19 viselkedésében bekövetkezett apró in vivo változások számszerűsítésére,20 a gázcsatorna felületi hidratációjának közvetlen mérésére. és a kezelés hatékonyságának korai indikátoraként használják.Ezenkívül az MCT pontozási módszerünk 10-35 µm átmérőjű, alumínium-oxidból vagy nagy törésmutatójú üvegből álló részecskéket használ a PB-PCXI21-gyel látható MCT markerekként.Mindkét módszer alkalmas számos részecsketípus, köztük MP-k képalkotására.
A nagy térbeli és időbeli felbontásnak köszönhetően a PB-PCXI alapú ASL és MCT vizsgálataink kiválóan alkalmasak egyedi és ömlesztett részecskék dinamikájának és viselkedési mintáinak in vivo tanulmányozására, hogy segítsenek megérteni és optimalizálni az MP génbejuttatási módszereket.Az általunk alkalmazott megközelítés a SPring-8 BL20B2 sugárvonalat használó vizsgálatainkon alapul, amelyek során a folyadék mozgását vizualizáltuk egy adag álvektor egerek orr- és pulmonális légútjába való bejuttatását követően, hogy segítsen megmagyarázni megfigyelt heterogén génexpressziós mintáinkat. a génünkben.állatkísérletek 3,4-es hordozódózissal.
Ennek a tanulmánynak a célja az volt, hogy a PB-PCXI szinkrotron segítségével vizuálisan megjelenítsék egy sor MP-k in vivo mozgását élő patkányok légcsőjében.Ezeket a PB-PCXI képalkotó vizsgálatokat az MP sorozat, a mágneses térerősség és a hely tesztelésére tervezték, hogy meghatározzák azok MP mozgására gyakorolt ​​hatását.Feltételeztük, hogy egy külső mágneses tér segít a szállított MF-nek a célterületen maradni vagy elmozdulni.Ezek a vizsgálatok lehetővé tették számunkra, hogy meghatározzuk azokat a mágnes konfigurációkat, amelyek maximalizálják a légcsőben a lerakódás után maradó részecskék mennyiségét.A tanulmányok második sorozatában arra törekedtünk, hogy ezt az optimális konfigurációt használjuk annak a transzdukciós mintázatnak a bemutatására, amely az LV-MP-k patkány légutakba való in vivo bejuttatásából ered, feltéve, hogy az LV-MP-k bejuttatása a légúti célzás összefüggésében eredményezné. megnövekedett LV transzdukciós hatékonyságban..
Minden állatkísérletet az Adelaide-i Egyetem (M-2019-060 és M-2020-022) és a SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee által jóváhagyott protokollok szerint végeztek.A kísérleteket az ARRIVE ajánlásainak megfelelően végeztük.
Az összes röntgenfelvételt a BL20XU sugárvonalon készítették a SPring-8 szinkrotronnál Japánban, a korábban leírthoz hasonló beállítással21,22.Röviden, a kísérleti doboz 245 m-re volt a szinkrotron tárológyűrűtől.A minta és a detektor közötti távolság 0,6 m a részecskeképalkotási vizsgálatokhoz, és 0,3 m az in vivo képalkotó vizsgálatokhoz a fáziskontraszt hatások létrehozása érdekében.25 keV energiájú monokromatikus nyalábot használtunk.A képeket egy sCMOS detektorhoz csatlakoztatott nagy felbontású röntgenátalakítóval (SPring-8 BM3) készítettük.A transzducer a röntgensugarakat látható fénnyé alakítja egy 10 µm vastag szcintillátor (Gd3Al2Ga3O12) segítségével, amelyet azután egy ×10 (NA 0,3) mikroszkópobjektív segítségével az sCMOS érzékelőre irányítanak.Az sCMOS detektor egy Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japán) volt, 2048 × 2048 pixel tömbmérettel és 6,5 × 6,5 µm nyers pixelmérettel.Ez a beállítás 0,51 µm effektív izotróp pixelméretet és körülbelül 1,1 mm × 1,1 mm látómezőt biztosít.A 100 ms-os expozíciós időtartamot úgy választották meg, hogy maximalizálják a mágneses részecskék jel-zaj arányát a légutakon belül és kívül, miközben minimalizálják a légzés okozta mozgási műtermékeket.Az in vivo vizsgálatokhoz egy gyors röntgenzárat helyeztek a röntgensugár útjába, hogy korlátozzák a sugárdózist azáltal, hogy blokkolják a röntgensugarat az expozíciók között.
LV médiát nem használtak egyetlen SPring-8 PB-PCXI képalkotó vizsgálatban sem, mivel a BL20XU képalkotó kamra nem rendelkezik 2. szintű biológiai biztonsági tanúsítvánnyal.Ehelyett egy sor jól jellemzett MP-t választottunk ki két kereskedelmi szállítótól, amelyek sokféle méretben, anyagban, vaskoncentrációban és alkalmazásban állnak rendelkezésre – először azért, hogy megértsük, hogyan befolyásolják a mágneses mezők az MP-k mozgását az üvegkapillárisokban, majd élő légutak.felület.Az MP mérete 0,25 és 18 µm között változik, és különféle anyagokból készül (lásd az 1. táblázatot), de az egyes minták összetétele, beleértve az MP-ben lévő mágneses részecskék méretét, nem ismert.Kiterjedt MCT-vizsgálataink (19, 20, 21, 23, 24) alapján arra számítunk, hogy az 5 µm-ig terjedő MP-k láthatók a légcső légutak felületén, például az egymást követő képkockák kivonásával az MP mozgásának jobb láthatósága érdekében.Egyetlen, 0,25 µm-es MP kisebb, mint a képalkotó eszköz felbontása, de a PB-PCXI várhatóan érzékeli a térfogati kontrasztjukat és a felületi folyadék mozgását, amelyen lerakódnak.
Minták a táblázatban minden MP-hez.Az 1-et 20 μl-es üvegkapillárisokban (Drummond Microcaps, PA, USA) állítottuk elő, belső átmérője 0,63 mm.A korpuszkuláris részecskék vízben, míg a CombiMag részecskék a gyártó szabadalmaztatott folyadékában állnak rendelkezésre.Mindegyik csövet félig megtöltjük folyadékkal (körülbelül 11 µl), és a mintatartóra helyezzük (lásd az 1. ábrát).Az üvegkapillárisokat vízszintesen helyeztük el a képalkotó kamrában lévő színpadon, és a folyadék szélein helyeztük el.Egy 19 mm átmérőjű (28 mm hosszú), ritkaföldfémből, neodímiumból, vasból és bórból (NdFeB) készült nikkelhéj mágnes (N35, kat. sz. LM1652, Jaycar Electronics, Ausztrália), amelynek remanenciája 1,17 T volt külön átviteli táblázat eléréséhez Távolról változtassa meg pozícióját renderelés közben.A röntgensugaras képalkotás akkor kezdődik, amikor a mágnes körülbelül 30 mm-rel a minta felett helyezkedik el, és a képek másodpercenként 4 képkocka sebességgel készülnek.A képalkotás során a mágnest az üvegkapilláriscső közelébe hozták (kb. 1 mm távolságra), majd a cső mentén mozgatva értékelték a térerősség és a helyzet hatását.
Egy in vitro képalkotó berendezés, amely MP mintákat tartalmaz üvegkapillárisokban az xy minta transzlációjának szakaszában.A röntgensugár útja piros pontozott vonallal van jelölve.
Miután megállapították az MP-k in vitro láthatóságát, egy részüket in vivo tesztelték vad típusú nőstény Wistar albínó patkányokon (~12 hetesek, ~200 g).Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japán), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japán) és butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).A patkányokat Pharma (Japán) keverékkel érzéstelenítettük intraperitoneális injekcióval.Érzéstelenítés után a légcső körüli szőrzet eltávolításával, endotracheális tubus behelyezésével (ET; 16 Ga intravénás kanül, Terumo BCT) készültek fel a képalkotásra, majd fekvő helyzetben rögzítették őket egy termikus zacskót tartalmazó, egyedi készítésű képalkotó lemezre. a testhőmérséklet fenntartásához.22. A képalkotó lemezt ezután enyhe szögben a képalkotó dobozban lévő mintaasztalhoz rögzítettük, hogy a légcső vízszintesen igazodjon a röntgenképen, amint az a 2a. ábrán látható.
(a) In vivo képalkotó beállítás a SPring-8 képalkotó egységben, vörös szaggatott vonallal jelölt röntgensugár útja.(b, c) A légcsőmágneses lokalizációt távolról végeztük két, egymásra merőlegesen szerelt IP-kamera segítségével.A képernyőn a kép bal oldalán látható a fejet tartó dróthurok és az ET cső belsejébe szerelt szállítókanült.
Egy 100 µl-es üvegfecskendőt használó távvezérelt fecskendős pumparendszert (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) PE10 csőhöz (0,61 mm OD, 0,28 mm belső átmérőjű) csatlakoztattunk 30 Ga tű segítségével.Jelölje meg a csövet annak biztosítására, hogy a hegye a megfelelő helyzetben legyen a légcsőben az endotracheális tubus behelyezésekor.Mikropumpa segítségével eltávolítottuk a fecskendő dugattyúját, és a cső hegyét belemerítettük a szállítandó MP mintába.A feltöltött szállítócsövet ezután az endotracheális csőbe helyeztük, a hegyét a várt alkalmazott mágneses mező legerősebb részére helyezve.A képfelvételt az Arduino-alapú időzítő dobozunkhoz csatlakoztatott légzésérzékelővel vezéreltük, és minden jelet (pl. hőmérséklet, légzés, redőny nyitás/zárás és képfelvétel) a Powerlab és a LabChart (AD Instruments, Sydney, Ausztrália) segítségével rögzítettünk. 22 Képalkotáskor Amikor a ház nem volt elérhető, két IP-kamerát (Panasonic BB-SC382) körülbelül 90°-os szögben helyeztek el egymáshoz képest, és a képalkotás során a mágnes légcsőhöz viszonyított helyzetének szabályozására szolgált (2b, c ábra).A mozgási műtermékek minimalizálása érdekében lélegzetenként egy képet készítettünk a terminális légzési áramlási plató alatt.
A mágnes a második fokozathoz van rögzítve, amely távolról is elhelyezhető a képalkotó test külső oldalán.A mágnes különböző helyzeteit és konfigurációit tesztelték, többek között: a légcső felett körülbelül 30°-os szögben elhelyezve (a konfigurációk a 2a. és 3a. ábrán láthatók);az egyik mágnes az állat fölött, a másik pedig alatta, a pólusok vonzásra vannak beállítva (3b. ábra)., egy mágnes az állat felett és egy alatta, a pólusok taszításra vannak beállítva (3c. ábra), és egy mágnes a légcső felett és arra merőlegesen (3d. ábra).Miután felállította az állatot és a mágnest, és betöltötte a vizsgált MP-t a fecskendős pumpába, adjon be 50 µl-es adagot 4 µl/sec sebességgel a képek elkészítése után.Ezután a mágnest előre-hátra mozgatják a légcső mentén vagy azon keresztül, miközben folytatják a képek készítését.
Mágneskonfiguráció az in vivo képalkotáshoz (a) egy mágnes a légcső felett, körülbelül 30°-os szögben, (b) két mágnes vonzására van beállítva, (c) két mágnes van konfigurálva taszításra, (d) egy mágnes a légcső felett és merőlegesen légcső.A megfigyelő lenézett a szájából a tüdőbe a légcsövön keresztül, és a röntgensugár áthaladt a patkány bal oldalán, és a jobb oldalon távozott.A mágnest vagy a légút hosszában mozgatják, vagy balra és jobbra a légcső felett a röntgensugár irányában.
Arra is törekedtünk, hogy meghatározzuk a részecskék láthatóságát és viselkedését a légutakban a légzés és a szívfrekvencia keveredésének hiányában.Ezért a képalkotási időszak végén az állatokat humánusan elaltatták pentobarbitál túladagolás miatt (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Néhány állatot a képalkotó platformon hagytak, és a légzés és a szívverés megszűnése után a képalkotási folyamatot megismételték, további adag MP hozzáadásával, ha nem volt látható MP a légutak felületén.
Az eredményül kapott képeket lapos és sötét mezőre korrigáltuk, majd filmmé állítottuk össze (20 képkocka/másodperc; 15–25 × normál sebesség a légzésszámtól függően) egy MATLAB nyelven írt egyéni szkript segítségével (R2020a, The Mathworks).
Az LV génvektor bejuttatásával kapcsolatos összes vizsgálatot az Adelaide Egyetem Laboratóriumi Állatkutató Központjában végezték, és a SPring-8 kísérlet eredményeinek felhasználásával vizsgálták, hogy az LV-MP bejuttatása mágneses tér jelenlétében fokozhatja-e a géntranszfert in vivo .Az MF és a mágneses tér hatásának értékelésére két állatcsoportot kezeltünk: az egyik csoporthoz mágneses elhelyezéssel ellátott LV MF-et, a másik csoporthoz pedig mágnes nélküli LV MF-et injektáltunk.
LV génvektorokat a korábban leírt módszerekkel állítottak elő 25, 26.A LacZ vektor egy sejtmagban lokalizált béta-galaktozidáz gént expresszál, amelyet az MPSV konstitutív promóter (LV-LacZ) vezérel, és amely kék reakcióterméket termel a transzdukált sejtekben, amely látható a tüdőszövet frontján és metszeteiben.A titrálást sejttenyészetekben végeztük a LacZ-pozitív sejtek számának manuális megszámlálásával hemocitométer segítségével, a titer TU/ml-ben való kiszámításához.A hordozóanyagokat -80°C-on mélyhűtve tartósítják, felhasználás előtt felolvasztják, és a CombiMag-hoz kötik 1:1 arányú keveréssel és jégen inkubálással legalább 30 percig a kiszállítás előtt.
Normál Sprague Dawley patkányok (n = 3/csoport, ~2-3 érzéstelenítés ip. 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Ausztrália) és 60 mg/kg ketamin (Ilium, Ausztrália) keverékével 1 hónapos korban) ip. ) injekció és nem műtéti orális kanül adása 16 Ga-s intravénás kanüllel.Annak biztosítására, hogy a légcsőszövet megkapja az LV transzdukciót, a korábban leírt mechanikai perturbációs protokollunkkal kondicionáltuk, amelyben a légcső felületét axiálisan dörzsöltük egy drótkosárral (N-Circle, nitinol kő extraktor hegy nélkül NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 p28.Ezután körülbelül 10 perccel a biológiai biztonsági szekrényben bekövetkezett zavarás után LV-MP tracheális beadását végeztük.
Az ebben a kísérletben használt mágneses mezőt az in vivo röntgenvizsgálathoz hasonlóan konfigurálták úgy, hogy ugyanazokat a mágneseket tartották a légcső felett desztillációs stentbilincsekkel (4. ábra).50 µl térfogatú LV-MP-t (2 x 25 µl alikvotokat) juttattunk a légcsőbe (n = 3 állat) gélvégű pipettával a korábban leírtak szerint.A kontrollcsoport (n = 3 állat) ugyanazt az LV-MP-t kapta mágnes használata nélkül.Az infúzió befejezése után a kanült eltávolítjuk az endotracheális tubusból, és az állatot extubáljuk.A mágnes 10 percig a helyén marad, mielőtt eltávolítaná.A patkányoknak szubkután meloxicamot (1 ml/kg) (Ilium, Ausztrália) adagoltunk, majd az érzéstelenítést 1 mg/kg atipamazol-hidroklorid (Antisedan, Zoetis, Ausztrália) intraperitoneális injekciójával megszüntettük.A patkányokat melegen tartottuk és megfigyeltük az érzéstelenítésből való teljes felépülésig.
LV-MP szállítóeszköz biológiai biztonsági szekrényben.Látható, hogy az ET cső világosszürke Luer-lock hüvelye kiemelkedik a szájból, és az ábrán látható gélpipetta hegye az ET csövön keresztül a kívánt mélységig a légcsőbe kerül.
Egy héttel az LV-MP beadási eljárás után az állatokat humánus módon leöltük 100%-os CO2 belélegzésével, és a LacZ expresszióját standard X-gal kezelésünkkel értékeltük.A három leginkább faroki porcgyűrűt eltávolítottuk annak biztosítására, hogy az endotracheális tubus elhelyezése miatti mechanikai sérülések vagy folyadékretenció ne kerüljön bele az elemzésbe.Mindegyik légcsövet hosszában levágtuk, hogy két felét analízishez kapjuk, és egy Minutien tűvel (Fine Science Tools) egy szilikongumit tartalmazó csészébe helyezzük (Sylgard, Dow Inc.), hogy megjelenítsük a luminális felületet.A transzdukált sejtek eloszlását és karakterét frontális fényképezéssel igazoltuk Nikon mikroszkóppal (SMZ1500) DigiLite kamerával és TCapture szoftverrel (Tucsen Photonics, Kína).A képek 20-szoros nagyítással készültek (beleértve a légcső teljes szélességére vonatkozó maximális beállítást is), a légcső teljes hosszát lépésről lépésre megjelenítve, elegendő átfedést biztosítva az egyes képek között ahhoz, hogy a képeket „összefűzni lehessen”.Az egyes légcsövekből származó képeket ezután egyetlen összetett képpé egyesítettük a Composite Image Editor 2.0.3-as verziójával (Microsoft Research) a planar motion algoritmus használatával. A LacZ-expresszió területét az egyes állatok tracheális összetett képein egy automatizált MATLAB-szkript (R2020a, MathWorks) segítségével határoztuk meg a korábban leírtak szerint28, 0,35 < Színárnyalat < 0,58, Telítettség > 0,15 és Érték < 0,7 beállításokkal. A LacZ-expresszió területét az egyes állatok tracheális összetett képeiben egy automatizált MATLAB-szkripttel (R2020a, MathWorks) határoztuk meg a korábban leírtak szerint28, 0,35 < Színárnyalat < 0,58, Telítettség> 0,15 és Érték < 0,7 beállításokkal. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. A LacZ-expresszió területét az egyes állatok összetett légcsőképein egy automatizált MATLAB-szkript (R2020a, MathWorks) segítségével határoztuk meg a korábban leírtak szerint28 0,35-ös beállításokkal.0,15 és érték<0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图像中的LacZ 表达区域进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 。………………………………………………………………………………………………………… Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Az egyes állatok légcsövéről készült összetett képeken a LacZ-expresszió területeit automatizált MATLAB-szkripttel (R2020a, MathWorks) számszerűsítettük a korábban leírtak szerint, 0,35 < színárnyalat < 0,58, telítettség > 0,15 és érték < 0,7 .A GIMP v2.10.24-ben a szövetkontúrok nyomon követésével minden egyes összetett képhez manuálisan hoztak létre egy maszkot a szövetterület azonosítására és a légcsőszöveten kívüli hamis észlelések megakadályozására.Az egyes állatok összesített képének festett területeit összeadtuk, hogy megkapjuk az adott állat teljes festett területét.A festett területet ezután elosztottuk a maszk teljes területével, hogy normalizált területet kapjunk.
Mindegyik légcsövet paraffinba ágyaztuk, és 5 µm vastag metszetet vágtunk.A metszeteket semleges gyorsvörös színnel festettük 5 percig, és a képeket Nikon Eclipse E400 mikroszkóp, DS-Fi3 kamera és NIS elemrögzítő szoftver (5.20.00 verzió) segítségével készítettük.
Minden statisztikai elemzést GraphPad Prism v9-ben (GraphPad Software, Inc.) végeztünk.A statisztikai szignifikancia értéke p ≤ 0,05.A normalitást Shapiro-Wilk teszttel, a LacZ festődés különbségeit pedig páratlan t-teszttel értékeltük.
Az 1. táblázatban leírt hat MP-t PCXI vizsgálta, a láthatóságot pedig a 2. táblázat írja le. Két polisztirol MP-t (MP1 és MP2; 18 µm, illetve 0,25 µm) nem látott a PCXI, de a többi mintát azonosítani tudtuk. (példák az 5. ábrán láthatók).Az MP3 és az MP4 gyengén látható (10-15% Fe3O4; 0,25 µm, illetve 0,9 µm).Bár az MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) tartalmazta a legkisebb vizsgált részecskéket, ez volt a legkifejezettebb.A CombiMag MP6 terméket nehéz megkülönböztetni.Az MF-ek észlelési képességét minden esetben nagymértékben javítottuk, ha a mágnest a kapillárissal párhuzamosan előre-hátra mozgattuk.Ahogy a mágnesek távolodtak a kapilláristól, a részecskék hosszú láncokban húzódtak ki, de a mágnesek közeledtével és a mágneses térerősség növekedésével a részecskeláncok lerövidültek, ahogy a részecskék a kapilláris felső felülete felé vándoroltak (lásd az S1 kiegészítő videót : MP4), növelve a részecskesűrűséget a felületen.Ezzel szemben, amikor a mágnest eltávolítják a kapillárisból, a térerősség csökken, és az MP-k hosszú láncokká rendeződnek át, amelyek a kapilláris felső felületétől nyúlnak ki (lásd az S2 kiegészítő videót: MP4).Miután a mágnes leállt, a részecskék az egyensúlyi helyzet elérése után még egy ideig tovább mozognak.Ahogy az MP a kapilláris felső felülete felé és onnan távolodik, a mágneses részecskék hajlamosak törmeléket szívni át a folyadékon.
Az MP láthatósága PCXI alatt jelentősen eltér a minták között.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 és (d) MP6.Az itt látható összes kép egy mágnessel készült, amely körülbelül 10 mm-rel közvetlenül a kapilláris felett helyezkedik el.A látszólagos nagy körök a kapillárisokban rekedt légbuborékok, amelyek jól mutatják a fáziskontraszt kép fekete-fehér széljegyeit.A piros négyzet a kontrasztot fokozó nagyítást jelzi.Vegye figyelembe, hogy a mágnesáramkörök átmérői az ábrákon nem méretarányosak, és körülbelül 100-szor nagyobbak az ábrán láthatónál.
Ahogy a mágnes balra és jobbra mozog a kapilláris tetején, az MP húr szöge megváltozik, hogy a mágneshez igazodjon (lásd a 6. ábrát), így kirajzolódik a mágneses erővonalak.Az MP3-5 esetében, miután az akkord elérte a küszöbszöget, a részecskék a kapilláris felső felületén húzódnak.Ez gyakran azt eredményezi, hogy az MP-k nagyobb csoportokba csoportosulnak a legerősebb mágneses tér közelében (lásd az S3 kiegészítő videót: MP5).Ez különösen nyilvánvaló a kapilláris végéhez közeli képalkotáskor is, amely a MP aggregálódását és a folyadék-levegő határfelületen való koncentrálódását okozza.Az MP6 részecskéi, amelyeket nehezebb volt megkülönböztetni, mint az MP3-5-ben, nem húzódtak, amikor a mágnes mozgott a kapillárison, de az MP húrok disszociáltak, így a részecskék láthatóvá váltak (lásd az S4 kiegészítő videót: MP6).Egyes esetekben, amikor az alkalmazott mágneses mezőt csökkentették a mágnesnek a képalkotás helyétől való nagy távolságra történő mozgatásával, a megmaradt MP-k a gravitáció hatására lassan leszálltak a cső alsó felületére, és a húrban maradtak (lásd az S5 kiegészítő videót: MP3) .
Az MP húr szöge megváltozik, ahogy a mágnes jobbra mozog a kapilláris felett.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 és (d) MP6.A piros négyzet a kontrasztot fokozó nagyítást jelzi.Kérjük, vegye figyelembe, hogy a további videók tájékoztató jellegűek, mivel fontos részecskestruktúrát és dinamikus információkat tárnak fel, amelyeket ezeken a statikus képeken nem lehet megjeleníteni.
Vizsgálataink kimutatták, hogy a mágnes lassú előre-hátra mozgatása a légcső mentén megkönnyíti az MF vizualizálását az összetett mozgás kontextusában in vivo.In vivo tesztet nem végeztünk, mert a polisztirol gyöngyök (MP1 és MP2) nem látszottak a kapillárisban.A fennmaradó négy MF mindegyikét in vivo tesztelték úgy, hogy a mágnes hosszú tengelye a légcső felett a függőlegeshez képest körülbelül 30°-os szöget zárt be (lásd a 2b. és 3a. ábrát), mivel ez hosszabb MF-láncokat eredményezett, és hatékonyabb volt. mint egy mágnes..konfiguráció megszakadt.MP3-at, MP4-et és MP6-ot nem találtak élő állatok légcsövében.Amikor az állatok humánus leölése után patkányok légzőrendszerét vizualizáltuk, a részecskék még akkor is láthatatlanok maradtak, ha fecskendős pumpával további térfogatot adtak hozzá.Az MP5-nek volt a legmagasabb vas-oxid tartalma, és ez volt az egyetlen látható részecske, ezért ezt használták az MP viselkedésének in vivo értékelésére és jellemzésére.
A mágnesnek a légcső feletti elhelyezése az MF beillesztése során azt eredményezte, hogy sok, de nem minden MF koncentrálódott a látómezőben.A részecskék légcsőbe való bejutása legjobban humánus módon elaltatott állatoknál figyelhető meg.A 7. ábra és az S6 kiegészítő videó: Az MP5 a részecskék gyors mágneses rögzítését és összehangolását mutatja a ventrális légcső felületén, jelezve, hogy az MP-k a légcső kívánt területeire irányíthatók.Az MF beadása után a légcső mentén távolabbi keresés során néhány MF-et találtak a karinához közelebb, ami azt jelzi, hogy nem volt elegendő mágneses térerősség az összes MF összegyűjtéséhez és megtartásához, mivel a folyadék beadása során a maximális mágneses térerősség tartományán keresztül jutottak el.folyamat.A szülés utáni MP-koncentrációk azonban magasabbak voltak a képterület környékén, ami arra utal, hogy sok MP maradt a légúti régiókban, ahol az alkalmazott mágneses térerősség a legmagasabb volt.
Képek (a) az MP5 bejuttatása előtt és (b) után egy nemrégiben elaltatott patkány légcsövébe mágnessel közvetlenül a képalkotó terület felett.Az ábrázolt terület két porcos gyűrű között helyezkedik el.Az MP leadása előtt folyadék van a légutakban.A piros doboz a kontrasztot fokozó nagyítást jelzi.Ezek a képek az S6: MP5 kiegészítő videóban szereplő videóból származnak.
A mágnes mozgatása a légcső mentén in vivo az MP lánc szögének változását eredményezte a légutak felületén, hasonlóan a kapillárisokban megfigyelthez (lásd a 8. ábrát és az S7 kiegészítő videót: MP5).Vizsgálatunkban azonban a parlamenti képviselőket nem lehetett az élő légutak felszínén húzni, ahogy a kapillárisok megtehetnék.Egyes esetekben az MP lánc meghosszabbodik, amikor a mágnes balra és jobbra mozog.Érdekes módon azt is megállapítottuk, hogy a részecskelánc megváltoztatja a folyadék felszíni rétegének mélységét, amikor a mágnest hosszirányban mozgatják a légcső mentén, és kitágul, ha a mágnest közvetlenül a fej fölé mozgatják, és a részecskeláncot függőleges helyzetbe forgatják (lásd Kiegészítő videó S7).: MP5 0:09-nél, jobbra lent).A jellegzetes mozgási minta megváltozott, amikor a mágnest oldalirányban mozgatták a légcső tetején (azaz az állattól balra vagy jobbra, nem pedig a légcső hosszában).A részecskék még mindig jól láthatóak voltak mozgásuk során, de amikor a mágnest eltávolították a légcsőből, a részecskefüzérek hegyei láthatóvá váltak (lásd az S8 kiegészítő videót: MP5, 0:08-tól).Ez megegyezik a mágneses tér megfigyelt viselkedésével egy üvegkapillárisban alkalmazott mágneses tér hatására.
Mintaképek, amelyek MP5-öt mutatnak egy élő érzéstelenített patkány légcsőjében.(a) A mágnest a légcső feletti és bal oldali képek készítésére használják, majd (b) a mágnes jobbra mozgatása után.A piros doboz a kontrasztot fokozó nagyítást jelzi.Ezek a képek az S7 MP5 kiegészítő videójában szereplő videóból származnak.
Amikor a két pólust észak-déli irányban hangoltuk a légcső felett és alatt (azaz vonz; 3b. ábra), az MP húrok hosszabbnak tűntek, és a légcső oldalsó falán helyezkedtek el, nem pedig a légcső háti felületén. légcső (lásd Függelék).Videó S9:MP5).Azonban a részecskék magas koncentrációját egy helyen (azaz a légcső háti felszínén) nem észlelték a kettős mágneses eszközzel történő folyadékbevitel után, ami általában egyetlen mágneses eszköznél fordul elő.Aztán amikor egy mágnest úgy konfiguráltak, hogy taszítsa az ellentétes pólusokat (3c. ábra), a látómezőben látható részecskék száma nem nőtt a szállítás után.Mindkét mágneses konfiguráció beállítása kihívást jelent a nagy mágneses térerősség miatt, amely vonzza vagy nyomja a mágneseket.A beállítást ezután egyetlen mágnesre változtatták, amely párhuzamos a légutakkal, de 90 fokos szögben halad át a légutakon, így az erővonalak merőlegesen keresztezik a légcső falát (3d. ábra), ez az orientáció a részecskék aggregációjának lehetőségét hivatott meghatározni. az oldalfal.figyelni kell.Ebben a konfigurációban azonban nem volt azonosítható MF-akkumulációs mozgás vagy mágnesmozgás.Mindezen eredmények alapján a génhordozók in vivo vizsgálatához egyetlen mágneses és 30 fokos orientációjú konfigurációt választottunk (3a. ábra).
Amikor az állatot többször is leképezték közvetlenül a humánus feláldozás után, a zavaró szövetmozgás hiánya azt jelentette, hogy finomabb, rövidebb részecskevonalakat lehetett észrevenni a tiszta porcközi mezőben, amelyek a mágnes transzlációs mozgásának megfelelően "imbolyogtak".tisztán látni az MP6 részecskék jelenlétét és mozgását.
Az LV-LacZ titere 1,8 x 108 NE/ml volt, és a CombiMag MP-vel (MP6) 1:1 arányban történő összekeverés után az állatokat 50 µl 9 x 107 NE/ml LV vivőanyag (azaz 4,5) légcsőbe fecskendezték. x 106 TU/patkány).).).Ezekben a vizsgálatokban a mágnes vajúdás közbeni mozgatása helyett egy pozícióban rögzítettük a mágnest, hogy meghatározzuk, (a) javítható-e az LV transzdukció a mágneses tér hiányában történő vektorszállításhoz képest, és (b) hogy a légutak legyen összpontosítva.A sejtek a felső légutak mágneses célterületein transzdukálódnak.
Úgy tűnt, hogy a mágnesek jelenléte és a CombiMag LV vektorokkal kombinációban történő alkalmazása nem befolyásolja károsan az állatok egészségét, ahogyan az sem a standard LV vektor szállítási protokollunkban.A mechanikai perturbációnak kitett légcsőrégió frontális képei (1. kiegészítő ábra) azt mutatták, hogy az LV-MP-vel kezelt csoport szignifikánsan magasabb transzdukciós szintet mutatott mágnes jelenlétében (9a. ábra).Csak kis mennyiségű kék ​​LacZ festődés volt jelen a kontrollcsoportban (9b. ábra).Az X-Gal festett normalizált régiók mennyiségi meghatározása azt mutatta, hogy az LV-MP mágneses tér jelenlétében történő beadása körülbelül hatszoros javulást eredményezett (9c. ábra).
Példa összetett képekre, amelyek a tracheális transzdukciót mutatják LV-MP-vel (a) mágneses tér jelenlétében és (b) mágnes hiányában.(c) Statisztikailag szignifikáns javulás a LacZ transzdukció normalizált területén a légcsőben mágnes használatával (*p = 0,029, t-teszt, n = 3 csoportonként, átlag ± standard hiba).
A semleges, gyorsan vörösre festett metszetek (a példa a 2. kiegészítő ábrán látható) azt mutatták, hogy a LacZ-festett sejtek ugyanabban a mintában és ugyanazon a helyen voltak, mint korábban közöltük.
A légúti génterápia legfontosabb kihívása továbbra is a hordozó részecskék pontos lokalizálása az érdeklődésre számot tartó területeken, valamint a transzdukciós hatékonyság magas szintjének elérése a mobil tüdőben légáramlás és aktív nyálkatisztítás jelenlétében.A cisztás fibrózis légúti megbetegedésének kezelésére szánt LV-hordozók esetében ez idáig elérhetetlen cél volt a hordozórészecskék tartózkodási idejének növelése a vezetőképes légutakban.Amint arra Castellani és munkatársai rámutattak, a mágneses mezők transzdukció fokozására való alkalmazása előnyökkel jár más génbejuttatási módszerekkel, például az elektroporációval szemben, mivel kombinálhatja az egyszerűséget, a gazdaságosságot, a lokalizált szállítást, a megnövekedett hatékonyságot és a rövidebb inkubációs időt.és esetleg kisebb dózisú vivőanyag10.Azonban a mágneses részecskék in vivo lerakódását és viselkedését a légutakban külső mágneses erők hatására még soha nem írták le, és valójában ennek a módszernek a képességét, hogy növelje a génexpressziós szintet ép élő légutakban, nem bizonyították in vivo.
A PCXI szinkrotronnal végzett in vitro kísérleteink azt mutatták, hogy az MP polisztirol kivételével minden általunk tesztelt részecske látható volt az általunk használt képalkotó elrendezésben.Mágneses tér jelenlétében a mágneses mezők húrokat alkotnak, amelyek hossza a részecskék típusától és a mágneses tér erősségétől (azaz a mágnes közelségétől és mozgásától) függ.A 10. ábrán látható módon az általunk megfigyelt húrok akkor jönnek létre, amikor minden egyes részecske mágnesezetté válik, és saját helyi mágneses terét indukálja.Ezek a különálló mezők más, hasonló részecskék összegyűjtését és összekapcsolódását okozzák a csoportos húrmozgások során, a többi részecskék helyi vonzási és taszító erejéből származó helyi erők miatt.
Diagram, amelyen (a, b) a folyadékkal teli kapillárisok belsejében képződő részecskeláncok és (c, d) egy levegővel töltött légcső látható.Vegye figyelembe, hogy a kapillárisok és a légcső nem húzódnak méretarányosan.Az (a) panel a láncokba rendezett Fe3O4 részecskéket tartalmazó MF leírását is tartalmazza.
Amikor a mágnes elmozdult a kapillárison, a részecskefüzér szöge elérte a Fe3O4-et tartalmazó MP3-5 kritikus küszöbét, ami után a részecskefüzér már nem maradt az eredeti helyzetében, hanem a felület mentén egy új pozícióba került.mágnes.Ez a hatás valószínűleg azért következik be, mert az üvegkapilláris felülete elég sima ahhoz, hogy lehetővé tegye ezt a mozgást.Érdekes módon az MP6 (CombiMag) nem viselkedett így, talán azért, mert a részecskék kisebbek voltak, más volt a bevonat vagy a felületi töltés, vagy a szabadalmaztatott hordozófolyadék befolyásolta a mozgásképességüket.A CombiMag részecskeképen a kontraszt is gyengébb, ami arra utal, hogy a folyadék és a részecskék azonos sűrűségűek lehetnek, ezért nem mozoghatnak könnyen egymás felé.A részecskék akkor is elakadhatnak, ha a mágnes túl gyorsan mozog, ami azt jelzi, hogy a mágneses térerősség nem mindig tudja legyőzni a folyadékban lévő részecskék közötti súrlódást, ami arra utal, hogy a mágneses térerősségnek, valamint a mágnes és a célterület közötti távolságnak nem szabad megegyeznie meglepetés.fontos.Ezek az eredmények azt is jelzik, hogy bár a mágnesek számos, a célterületen átáramló mikrorészecskét képesek megragadni, nem valószínű, hogy mágnesekre lehet támaszkodni a CombiMag részecskék légcső felszínén történő mozgatására.Így arra a következtetésre jutottunk, hogy az in vivo LV MF vizsgálatoknak statikus mágneses tereket kell használniuk a légúti fa meghatározott területeinek fizikai megcélzására.
Miután a részecskék bejutottak a testbe, nehéz azonosítani őket a test összetett mozgó szöveteivel összefüggésben, de észlelési képességük javult, mivel a mágnest vízszintesen mozgatják a légcső felett, hogy „mozgassa” az MP húrokat.Bár a valós idejű képalkotás lehetséges, könnyebben észlelhető a részecskék mozgása, miután az állatot humánus módon megölték.Az MP-koncentráció általában ezen a helyen volt a legmagasabb, amikor a mágnest a képalkotó terület fölé helyezték, bár néhány részecskét általában a légcsőben lejjebb találtak.Ellentétben az in vitro vizsgálatokkal, a részecskéket nem lehet lehúzni a légcsőben egy mágnes mozgásával.Ez a megállapítás összhangban van azzal, hogy a légcső felületét borító nyálka általában hogyan dolgozza fel a belélegzett részecskéket, befogja azokat a nyálkahártyába, majd kitisztítja a nyálkahártya-ciliáris kiürítő mechanizmuson keresztül.
Feltételeztük, hogy a légcső feletti és alatti mágnesek vonzás céljából történő használata (3b. ábra) egyenletesebb mágneses mezőt eredményezhet, nem pedig egy ponton erősen koncentrált mágneses mezőt, ami potenciálisan egyenletesebb részecskék eloszlását eredményezheti..Előzetes tanulmányunk azonban nem talált egyértelmű bizonyítékot e hipotézis alátámasztására.Hasonlóképpen, egy pár mágnes taszításra állítása (3c. ábra) nem eredményezett több részecske ülepedést a képterületen.Ez a két eredmény azt mutatja, hogy a kétmágneses beállítás nem javítja jelentősen az MP-mutatás helyi vezérlését, és hogy az ebből eredő erős mágneses erőket nehéz behangolni, így ez a megközelítés kevésbé praktikus.Hasonlóképpen, a mágnes légcső feletti és keresztirányú orientálása (3d. ábra) szintén nem növelte a leképezett területen maradó részecskék számát.Ezen alternatív konfigurációk némelyike ​​nem biztos, hogy sikeres, mivel a mágneses térerősség csökkenését eredményezi a leválasztási zónában.Így a 30 fokos egymágneses konfiguráció (3a. ábra) a legegyszerűbb és leghatékonyabb in vivo vizsgálati módszernek tekinthető.
Az LV-MP vizsgálat kimutatta, hogy amikor az LV-vektorokat CombiMag-gal kombinálták, és mágneses tér jelenlétében fizikailag megzavarták őket, a transzdukciós szint jelentősen megnőtt a légcsőben a kontrollokhoz képest.A szinkrotron képalkotó vizsgálatok és a LacZ eredmények alapján úgy tűnt, hogy a mágneses tér képes megtartani az LV-t a légcsőben, és csökkenti azon vektorrészecskék számát, amelyek azonnal mélyen behatoltak a tüdőbe.Az ilyen célzási fejlesztések nagyobb hatékonysághoz vezethetnek, miközben csökkentik a leadott titereket, a nem célzott transzdukciót, a gyulladásos és immunmellékhatásokat, valamint a génátviteli költségeket.Fontos, hogy a gyártó szerint a CombiMag más génátviteli módszerekkel kombinálva is használható, beleértve más vírusvektorokat (például AAV) és nukleinsavakat.