Köszönjük, hogy meglátogatta a Nature.com oldalt.Az Ön által használt böngészőverzió korlátozott CSS-támogatással rendelkezik.A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon frissített böngészőt (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben).Addig is a folyamatos támogatás érdekében a webhelyet stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg.
A Toxoplasma gondii egy intracelluláris protozoon parazita, amely modulálja a fertőzött gazdaszervezet mikrokörnyezetét, és köztudottan összefüggésbe hozható az agydaganat növekedésének gyakoriságával.Ebben a tanulmányban azt feltételezzük, hogy a Toxoplasma fertőzésből származó exoszomális miRNS-21 elősegíti az agydaganat növekedését.Jellemeztük a toxoplazmával fertőzött BV2 mikroglia exoszómáit, és megerősítették az U87 gliómasejtek internalizációját.Az exoszómális mikroRNS-expressziós profilokat a Toxoplasma gondii-vel kapcsolatos mikroRNS és mikroRNS-21A-5p tömbök és a tumorok válogatása segítségével elemeztük.Vizsgáltuk továbbá a tumorhoz kapcsolódó gének mRNS szintjét U87 glióma sejtekben az exoszómák miR-21 szintjének megváltoztatásával, valamint az exoszómák hatását a humán U87 glióma sejtproliferációra.A Toxoplasma gondii-vel fertőzött U87 gliomasejtek exoszómáiban a mikroRNS-21 expressziója megnövekszik, és a daganatellenes gének (FoxO1, PTEN és PDCD4) aktivitása csökken.A Toxoplasmával fertőzött BV2-eredetű exoszómák U87 gliómasejtek proliferációját indukálják.Az exoszómák U87 sejtek növekedését indukálják egértumor modellben.Azt javasoljuk, hogy a megnövekedett exoszomális miR-21 a toxoplazmával fertőzött BV2 mikrogliákban fontos szerepet játszhat sejtnövekedést elősegítő anyagként az U87 glióma sejtekben a tumorellenes gének leszabályozása révén.
Becslések szerint 2018-ban világszerte több mint 18,1 millió előrehaladott rákos esetet diagnosztizáltak, és évente körülbelül 297 000 központi idegrendszeri daganatot diagnosztizálnak (az összes daganat 1,6%-a)1.Korábbi kutatások kimutatták, hogy az emberi agydaganatok kialakulásának kockázati tényezői közé tartoznak a különböző vegyszerek, a családtörténet, valamint a fejterápiás és diagnosztikai berendezések ionizáló sugárzása.E rosszindulatú daganatok pontos oka azonban nem ismert.Világszerte a rákos megbetegedések körülbelül 20%-át fertőző ágensek okozzák, beleértve a vírusokat, baktériumokat és parazitákat3,4.A fertőző kórokozók megzavarják a gazdasejt genetikai mechanizmusait, például a DNS-javítást és a sejtciklust, és krónikus gyulladáshoz és az immunrendszer károsodásához vezethetnek5.
Az emberi rákkal kapcsolatos fertőző ágensek a leggyakoribb vírusos kórokozók, beleértve a humán papillomavírusokat és a hepatitis B és C vírusokat.A paraziták potenciális szerepet játszhatnak az emberi rák kialakulásában is.Számos parazitafaj, nevezetesen a Schistosoma, az Opishorchis viverrini, az O. felineus, a Clonorchis sinensis és a Hymenolepis nana, szerepet játszanak az emberi rák különböző típusaiban 6, 7, 8.
A Toxoplasma gondii egy intracelluláris protozoon, amely szabályozza a fertőzött gazdasejtek mikrokörnyezetét.Ez a parazita a becslések szerint a világ népességének körülbelül 30%-át fertőzi meg, és az egész populációt veszélyezteti9,10.A Toxoplasma gondii megfertőzheti a létfontosságú szerveket, beleértve a központi idegrendszert (CNS), és súlyos betegségeket, például halálos agyhártyagyulladást és agyvelőgyulladást okozhat, különösen az immunhiányos betegeknél9.A Toxoplasma gondii azonban megváltoztathatja a fertőzött gazdaszervezet környezetét is azáltal, hogy modulálja a sejtnövekedést és az immunválaszt immunkompetens egyénekben, ami tünetmentes krónikus fertőzés fenntartásához vezet9,11.Érdekes módon, tekintettel a T. gondii prevalenciája és az agydaganat előfordulása közötti összefüggésre, egyes jelentések arra utalnak, hogy a krónikus T. gondii fertőzés miatti in vivo gazdakörnyezeti változások hasonlítanak a tumor mikrokörnyezetére.
Az exoszómák intercelluláris kommunikátorokként ismertek, amelyek biológiai tartalmat, köztük fehérjéket és nukleinsavakat szállítanak a szomszédos sejtekből16,17.Az exoszómák befolyásolhatják a tumorral kapcsolatos biológiai folyamatokat, például az apoptózis elleni védekezést, az angiogenezist és a metasztázisokat a tumor mikrokörnyezetében.Különösen a miRNS-ek (miRNS-ek), kisméretű, körülbelül 22 nukleotid hosszúságú, nem kódoló RNS-ek, fontos poszt-transzkripciós génszabályozók, amelyek az emberi mRNS több mint 30%-át szabályozzák a miRNS-indukált csendesítő komplexen (miRISC) keresztül.A Toxoplasma gondii megzavarhatja a biológiai folyamatokat azáltal, hogy szabályozza a miRNS expresszióját a fertőzött gazdaszervezetekben.A gazdaszervezet miRNS-ei fontos jeleket tartalmaznak a gazdaszervezet biológiai folyamatainak szabályozásához, hogy elérjék a parazita túlélési stratégiáját.Így a gazdaszervezet miRNS-profiljában bekövetkezett változások tanulmányozása a T. gondii-vel való fertőzés után segíthet megérteni a gazdaszervezet és a T. gondii közötti kölcsönhatást.Valójában Thirugnanam et al.15 azt javasolta, hogy a T. gondii elősegíti az agy karcinogenezisét azáltal, hogy megváltoztatja expresszióját a tumornövekedéshez kapcsolódó specifikus miRNS-eken, és azt találta, hogy a T. gondii gliomákat okozhat kísérleti állatokban.
Ez a tanulmány a Toxoplasma BV2-vel fertőzött gazda mikroglia exoszomális miR-21 változására összpontosít.Megfigyeltük a megváltozott exoszomális miR-21 lehetséges szerepét az U87 gliómasejtek növekedésében a FoxO1/p27 sejtmagban való visszatartása miatt, amely a túlzottan expresszált miR-21 célpontja.
A BV2-ből származó exoszómákat differenciális centrifugálással nyertük, és különböző módszerekkel validáltuk, hogy megakadályozzuk a sejtkomponensekkel vagy más vezikulákkal való szennyeződést.Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) eltérő mintázatot mutatott a BV2 sejtekből és az exoszómákból kivont fehérjék között (1A. ábra), és a mintákat Alix jelenlétére értékelték, amelyet az exoszomális fehérjemarkerek Western-blot-vizsgálatával elemeztek .Alix jelölést találtak az exoszóma fehérjékben, de nem a BV2 sejtlizátum fehérjékben (1B. ábra).Ezenkívül a BV2-ből származó exoszómákból származó tisztított RNS-t bioanalizátorral elemeztük.A 18S és 28S riboszómális alegységeket ritkán figyelték meg az exoszomális RNS migrációs mintázatában, ami megbízható tisztaságot jelez (1C. ábra).Végül a transzmissziós elektronmikroszkópos vizsgálat kimutatta, hogy a megfigyelt exoszómák körülbelül 60–150 nm méretűek, és az exoszóma morfológiájára jellemző csészeszerű szerkezettel rendelkeznek (1D. ábra).
A BV2 sejtekből származó exoszómák jellemzése.(A) Biztonsági adatlap oldal.A fehérjéket BV2 sejtekből vagy BV2-ből származó exoszómákból izoláltuk.A fehérjemintázatok különböznek a sejtek és az exoszómák között.(B) Exoszomális marker (Alix) Western blot analízise.(C) BV2 sejtekből és BV2-ből származó exoszómákból származó tisztított RNS értékelése bioanalizátor segítségével.Így a BV2 sejtekben a 18S és 28S riboszómális alegységeket ritkán találták meg az exoszomális RNS-ben.(D) Transzmissziós elektronmikroszkóppal kimutatták, hogy a BV2 sejtekből izolált exoszómák 2%-os uranil-acetáttal negatívan festődnek.Az exoszómák körülbelül 60-150 nm méretűek és csésze alakúak (Song és Jung, nem publikált adatok).
A BV2-eredetű exoszómák sejtes internalizációját U87 humán gliómasejtekbe konfokális mikroszkóppal figyelték meg.A PKH26-tal jelölt exoszómák az U87 sejtek citoplazmájában lokalizálódnak.A sejtmagokat DAPI-val festették meg (2A. ábra), ami azt jelzi, hogy a BV2-eredetű exoszómákat a gazdasejtek internalizálhatják, és befolyásolhatják a befogadó sejtek környezetét.
A BV2-eredetű exoszómák U87 gliómasejtekbe történő internalizálása és a Toxoplasma RH-val fertőzött BV2-eredetű exoszómák U87 gliómasejtek proliferációját indukálta.(A) Az U87 sejtek által elnyelt exoszómák konfokális mikroszkóppal mérve.Az U87 glióma sejteket PKH26-tal (piros) vagy kontroll nélkül jelölt exoszómákkal inkubáltuk 24 órán át.A sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük, majd konfokális mikroszkóp alatt (skála: 10 μm, 3000) megfigyeltük.(B) Az U87 glióma sejtproliferációt sejtproliferációs vizsgálattal határoztuk meg.Az U87 glióma sejteket exoszómákkal kezeltük a jelzett ideig. *P < 0,05 a Student-féle t-próbával. *P < 0,05 a Student-féle t-próbával. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 Student-féle t-próbával. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Student-féle t-próbával kapott.
Miután megerősítettük a BV2-eredetű exoszómák U87 gliómasejtekbe való beépülését, sejtproliferációs vizsgálatokat végeztünk, hogy megvizsgáljuk a BV2-eredetű Toxoplasma-eredetű exoszómák szerepét a humán gliómasejtek fejlődésében.Az U87-sejtek kezelése T. gondii-vel fertőzött BV2-sejtekből származó exoszómákkal azt mutatta, hogy a T. gondii-vel fertőzött BV2-eredetű exoszómák az U87-sejtek szignifikánsan nagyobb proliferációját okozták a kontrollhoz képest (2B. ábra).
Ezenkívül az U118 sejtek növekedése ugyanazokat az eredményeket érte el, mint az U87, mivel a Toxoplasma által stimulált exoszómák okozták a legmagasabb szintű proliferációt (az adatokat nem mutatjuk be).Ezen adatok alapján kijelenthetjük, hogy a BV2-eredetű Toxoplasma-fertőzött exoszómák fontos szerepet játszanak a gliomasejtek proliferációjában.
A Toxoplasma-fertőzött BV2-eredetű exoszómák daganatfejlődésre gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára U87 glióma sejteket fecskendeztünk csupasz egerekbe xenograft modellhez, és BV2-eredetű exoszómákat vagy RH-fertőzött BV2-eredetű exoszómákat injektáltunk.Miután a daganatok 1 hét elteltével nyilvánvalóvá váltak, minden 5 egérből álló kísérleti csoportot felosztottunk a tumor méretének megfelelően, hogy meghatározzuk ugyanazt a kiindulási pontot, és a tumor méretét 22 napon keresztül mérjük.
Az U87 xenograft modellt használó egerekben a BV2-eredetű RH-fertőzött exoszómacsoportban a 22. napon szignifikánsan nagyobb tumorméretet és -súlyt figyeltek meg (3A. és B. ábra).Másrészt nem volt szignifikáns különbség a tumor méretében a BV2-eredetű exoszóma csoport és a kontrollcsoport között az exoszóma kezelést követően.Ezenkívül a gliómasejtekkel és exoszómákkal injektált egerek vizuálisan mutatták a legnagyobb tumortérfogatot az RH-fertőzött BV2-eredetű exoszómák csoportjában (3C. ábra).Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a BV2-eredetű Toxoplasma-fertőzött exoszómák glióma növekedést indukálnak egértumor modellben.
BV2-eredetű exoszómák onkogenezise (AC) U87 xenograft egérmodellben.A tumor mérete (A) és súlya (B) szignifikánsan megnőtt a BALB/c csupasz egerekben, amelyeket BV2-ből származó RH-fertőzött exoszómákkal kezeltek.BALB/c csupasz egereket (C) szubkután injektáltunk Matrigel keverékben szuszpendált 1 x 107 U87 sejttel.Hat nappal az injekció után 100 μg BV2-eredetű exoszómát kezeltünk egerekben.A daganat méretét és tömegét a jelzett napokon és a leölés után mértük. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Az adatok azt mutatták, hogy 37 miRNS (16 túlexpresszált és 21 csökkent), amelyek immunitással vagy tumorfejlődéssel kapcsolatosak, szignifikánsan megváltoztak a mikrogliákban a Toxoplasma RH törzzsel való fertőzés után (4A. ábra).A miR-21 relatív expressziós szintjét a megváltozott miRNS-ek között valós idejű RT-PCR-rel igazoltuk a BV2-ből származó, BV2-vel és U87 sejtekkel kezelt exoszómákban.A miR-21 expressziója jelentős növekedést mutatott a Toxoplasma gondii-vel (RH törzs) fertőzött BV2-sejtek exoszómáiban (4B. ábra).A miR-21 relatív expressziós szintje a BV2 és U87 sejtekben megemelkedett a megváltozott exoszómák felvétele után (4B. ábra).A miR-21 expressziójának relatív szintje a daganatos betegek agyszövetében, illetve Toxoplasma gondii-vel (ME49 törzs) fertőzött egerekben magasabb volt, mint a kontrollokban (4C. ábra).Ezek az eredmények korrelálnak a megjósolt és megerősített mikroRNS-ek expressziós szintjei közötti különbségekkel in vitro és in vivo.
Az exoszomális miP-21a-5p expressziójának változásai Toxoplasma gondii-vel (RH) fertőzött mikrogliákban.(A) Jelentős változásokat mutat be az siRNS-ben, amely a T. gondii RH fertőzést követően immunitáshoz vagy tumor kialakulásához kapcsolódik.(B) A relatív miR-21 expressziós szinteket valós idejű RT-PCR-rel detektáltuk BV2-eredetű exoszómákban, BV2-vel kezelt exoszómákban és U87-sejtekben.(C) Relatív miR-21 expressziós szintet találtunk daganatos betegek (N=3) és Toxoplasma gondii-vel (ME49 törzs) fertőzött egerek agyszövetében (N=3). *P < 0,05 a Student-féle t-próbával. *P < 0,05 a Student-féle t-próbával. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 Student-féle t-próbával kaptuk. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Student-féle t-próbával kapott.
Az RH-fertőzött BV2 sejtekből származó exoszómák gliómák növekedéséhez vezettek in vivo és in vitro (2. és 3. ábra).A releváns mRNS-ek kimutatásához megvizsgáltuk az antitumor célgének, a forkhead box O1 (FoxO1), a PTEN és a programozott sejthalál 4 (PDCD4) mRNS szintjét BV2-ből vagy RH BV2-ből származó exoszómákkal fertőzött U87 sejtekben.A bioinformatikai elemzés kimutatta, hogy számos daganathoz kapcsolódó gén, köztük a FoxO1, PTEN és PDCD4 gén, rendelkezik miR-2121,22 kötőhellyel.A daganatellenes célgének mRNS-szintje csökkent az RH-fertőzött BV2-eredetű exoszómákban a BV2-eredetű exoszómákhoz képest (5A. ábra).A FoxO1 csökkent fehérjeszintet mutatott az RH-fertőzött BV2-eredetű exoszómákban a BV2-eredetű exoszómákhoz képest (5B. ábra).Ezen eredmények alapján megerősítettük, hogy az RH-fertőzött BV2-ből származó exoszómák leszabályozzák az anti-onkogén géneket, fenntartva a tumornövekedésben betöltött szerepüket.
A Toxoplasma RH-fertőzött BV2-eredetű exoszómák a tumorellenes gének elnyomását indukálják U87 gliómasejtekben a Toxoplasma RH-fertőzött BV2-eredetű exoszómákkal.(A) A FoxO1, PTEN és PDCD4 expressziójának valós idejű PCR-je a T. gondii RH-fertőzött BV2-ből származó exoszómákban, összehasonlítva a PBS exoszómákkal.Kontrollként β-aktin mRNS-t használtunk.(B) A FoxO1 expresszióját Western blottal határoztuk meg, és a denzitometriás adatokat az ImageJ programmal statisztikailag értékeltük. *P < 0,05 a Student-féle t-próbával. *P < 0,05 a Student-féle t-próbával. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 Student-féle t-próbával kaptuk. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 Student-féle t-próbával kapott.
A miP-21 exoszómákban a tumorhoz kapcsolódó génszabályozásra gyakorolt ​​hatásának megértéséhez az U87 sejteket miP-21 inhibitorral transzfektáltuk Lipofectamine 2000 alkalmazásával, és a sejteket a transzfekció után 24 órával összegyűjtöttük.A miR-21 inhibitorokkal transzfektált sejtekben a FoxO1 és p27 expressziós szinteket a BV2-eredetű exoszómákkal kezelt sejtekkel hasonlítottuk össze qRT-PCR segítségével (6A, B ábra).A miR-21 inhibitor transzfekciója U87 sejtekbe jelentősen csökkentette a FoxO1 és p27 expresszióját (6. ábra).
Az RH-fertőzött exoszomális BV2-eredetű miP-21 megváltoztatta a FoxO1/p27 expresszióját U87 glióma sejtekben.Az U87 sejteket miP-21 inhibitorral transzfektáltuk Lipofectamine 2000 alkalmazásával, és a sejteket a transzfekció után 24 órával összegyűjtöttük.A miR-21 inhibitorokkal transzfektált sejtek FoxO1 és p27 expressziós szintjét a BV2-eredetű exoszómákkal kezelt sejtek szintjeivel hasonlítottuk össze qRT-PCR segítségével (A, B).
Hogy elkerülje a gazdaszervezet immunválaszát, a Toxoplasma parazita szöveti cisztává alakul.Különböző szövetekben, köztük az agyban, a szívben és a vázizomzatban parazitálnak a gazdaszervezet egész életében, és modulálják a gazdaszervezet immunválaszát.Ezenkívül szabályozhatják a gazdasejtek sejtciklusát és apoptózisát, elősegítve proliferációjukat14,24.A Toxoplasma gondii túlnyomórészt a gazda dendrites sejtjeit, a neutrofileket és a monocita/makrofág vonalat fertőzi meg, beleértve az agyi mikrogliát is.A Toxoplasma gondii indukálja az M2 fenotípusú makrofágok differenciálódását, befolyásolja a kórokozó fertőzés utáni sebgyógyulást, valamint hipervaszkularizációval és granulomatózus fibrózissal is összefüggésbe hozható.A Toxoplasma fertőzésnek ez a viselkedési patogenezise összefüggésbe hozható a tumorfejlődéssel kapcsolatos markerekkel.A Toxoplasma által szabályozott ellenséges környezet a megfelelő rákmegelőzőhöz hasonlíthat.Ezért feltételezhető, hogy a Toxoplasma fertőzésnek hozzá kell járulnia az agydaganatok kialakulásához.Valójában a Toxoplasma fertőzés magas arányáról számoltak be a különböző agydaganatokban szenvedő betegek szérumában.Ezenkívül a Toxoplasma gondii egy másik rákkeltő effektor is lehet, és szinergikusan hat más fertőző rákkeltő anyagok agydaganatának kialakulásában.Ezzel kapcsolatban érdemes megjegyezni, hogy a P. falciparum és az Epstein-Barr vírus szinergikusan hozzájárul a Burkitt limfóma kialakulásához.
Az exoszómák szabályozóként betöltött szerepét a rákkutatás területén alaposan vizsgálták.A paraziták és a fertőzött gazdaszervezetek közötti exoszómák szerepe azonban továbbra is kevéssé ismert.Eddig különböző szabályozók, köztük a szekretált fehérjék, megmagyarázták azokat a biológiai folyamatokat, amelyek révén a protozoon paraziták ellenállnak a gazdaszervezet támadásának, és állandósítják a fertőzést.Az utóbbi időben egyre inkább elterjedt az az elképzelés, hogy a protozoonokhoz kapcsolódó mikrovezikulák és mikroRNS-eik kölcsönhatásba lépnek a gazdasejtekkel, hogy kedvező környezetet teremtsenek a túlélésükhöz.Ezért további vizsgálatokra van szükség a megváltozott exoszomális miRNS-ek és a glióma sejtproliferáció közötti kapcsolat felderítésére.A mikroRNS-módosítás (miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 és miR-17-92 klasztergének) a toxoplazmával fertőzött humán makrofágokban a STAT3 promoterhez kötődik, szabályozott és anti-indukál. - Toxoplasma gondii fertőzésre adott apoptózis 29 .A toxoplazma fertőzés fokozza a miR-17-5p és a miR-106b-5p expresszióját, amelyek számos hiperproliferatív betegséghez kapcsolódnak 30 .Ezek az adatok arra utalnak, hogy a Toxoplasma fertőzés által szabályozott gazda miRNS-ek fontos molekulák a paraziták túlélése és patogenezise szempontjából a gazdaszervezet biológiai viselkedésében.
A megváltozott miRNS-ek különböző típusú viselkedést befolyásolhatnak a rosszindulatú sejtek, köztük a gliómák kezdete és progressziója során: a növekedési jelek önellátása, a növekedést gátló jelekre való érzéketlenség, az apoptózis elkerülése, a korlátlan replikációs potenciál, angiogenezis, invázió és metasztázis, valamint gyulladás.Gliomában több expressziós profilozási vizsgálatban megváltozott miRNS-eket azonosítottak.
Jelen vizsgálatunkban megerősítettük a miRNS-21 magas szintű expresszióját toxoplazmával fertőzött gazdasejtekben.A miR-21-et az egyik leggyakrabban túlexpresszált mikroRNS-ként azonosították szilárd daganatokban, beleértve a gliómákat is,33 és expressziója korrelál a glióma fokozatával.A felhalmozódó bizonyítékok arra utalnak, hogy a miR-21 egy új onkogén, amely anti-apoptotikus faktorként működik a glióma növekedésében, és erősen túlzottan expresszálódik az emberi agy rosszindulatú daganatainak szöveteiben és plazmájában.Érdekes módon a miR-21 inaktivációja glióma sejtekben és szövetekben a sejtproliferáció gátlását váltja ki a kaszpáz-függő apoptózis miatt.A miR-21 előrejelzett célpontjainak bioinformatikai elemzése több apoptózisúttal kapcsolatos tumorszuppresszor gént tárt fel, beleértve a programozott sejthalált 4-et (PDCD4), a tropomiozint (TPM1), a PTEN-t és a forkhead box O1-et (FoxO1), a miR-2121 kötőhellyel..22.38.
A FoxO1, mint az egyik transzkripciós faktor (FoxO), részt vesz a különböző típusú humán rák kialakulásában, és szabályozhatja a tumorszuppresszor gének, például a p21, p27, Bim és FasL40 expresszióját.A FoxO1 képes megkötni és aktiválni a sejtciklus-gátlókat, például a p27-et, hogy elnyomja a sejtnövekedést.Ezenkívül a FoxO1 a PI3K/Akt jelátvitel kulcsfontosságú effektora, és számos biológiai folyamatot szabályoz, például a sejtciklus progresszióját és a sejtdifferenciációt a p2742 transzkripció aktiválása révén.
Összefoglalva, úgy gondoljuk, hogy a toxoplazmával fertőzött mikrogliákból származó exoszomális miR-21 fontos szerepet játszhat a gliómasejtek növekedési szabályozójaként (7. ábra).További vizsgálatokra van azonban szükség, hogy közvetlen kapcsolatot találjanak az exoszomális miR-21, a megváltozott Toxoplasma fertőzés és a glióma növekedése között.Ezek az eredmények várhatóan kiindulópontot jelentenek a Toxoplasma fertőzés és a glióma előfordulási gyakorisága közötti kapcsolat tanulmányozásához.
Ebben a tanulmányban a glióma (agy) karcinogenezisének mechanizmusának sematikus diagramját javasoljuk.A szerző PowerPoint 2019-ben rajzol (Microsoft, Redmond, WA).
Ebben a vizsgálatban minden kísérleti protokoll, beleértve az állatok felhasználását is, összhangban volt a Szöuli Nemzeti Egyetem Állatgondozási és Felhasználói Bizottságának standard etikai irányelveivel, és a Szöuli Nemzeti Egyetem Orvostudományi Karának Intézményi Felülvizsgáló Testülete hagyta jóvá (IRB szám: SNU- 150715).-2).Minden kísérleti eljárást az ARRIVE ajánlásainak megfelelően végeztünk.
A BV2 egér mikroglia és U87 humán glióma sejteket Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) és Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene) táptalajban tenyésztettük, amelyek mindegyike 10% magzati szarvasmarha szérumot, 4 mM l-t tartalmazott. glutamin, 0,2 mM penicillin és 0,05 mM sztreptomicin.A sejteket 5% CO2-t tartalmazó inkubátorban tenyésztettük 37 °C-on.Egy másik glióma sejtvonalat, az U118-at használtuk az U87 sejtekkel való összehasonlításra.
A T. gondii-vel fertőzött RH és ME49 törzsekből származó exoszómák izolálására a T. gondii tachyzoites (RH törzs) 3-4 nappal korábban injektált 6 hetes BALB/c egerek hasüregéből gyűjtöttünk be.A tachyzoitákat háromszor mostuk PBS-sel, és centrifugálással tisztítottuk 40%-os Percollban (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Az ME49 törzs tachyzoitáinak előállításához BALB/c egerekbe intraperitoneálisan 20 szövetcisztát injektáltunk, és a fertőzést követő 6-8. napon a hasüreg mosásával összegyűjtöttük a cisztákban lévő tachyzoit transzformációt (PI).PBS-sel fertőzött egerek.Az ME49 tachyzoitákat 100 μg/ml penicillinnel (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml sztreptomicinnel (Gibco/BRL) és 5% magzati szarvasmarha szérummal (Lonza, Walkersville, MD) kiegészített sejtekben növesztettük. .., USA) 37 °C-on és 5% szén-dioxiddal.Vero sejtekben történő tenyésztést követően az ME49 tachyzoitákat kétszer átengedtük egy 25 gauge tűn, majd egy 5 µm-es szűrőn, hogy eltávolítsuk a törmeléket és a sejteket.Mosás után a tachyzoitokat PBS44-ben újraszuszpendáltuk.A Toxoplasma gondii ME49 törzs szöveti cisztáit fertőzött C57BL/6 egerek agyából izolált ciszták intraperitoneális injekciójával tartottuk fenn (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Az ME49-fertőzött egerek agyát 3 hónapos PI után gyűjtöttük be, és mikroszkóp alatt aprítottuk a ciszták izolálására.A fertőzött egereket speciális patogénmentes körülmények között (SPF) tartották a Szöuli Nemzeti Egyetem Orvostudományi Karán.
A teljes RNS-t BV2-eredetű exoszómákból, BV2-sejtekből és szövetekből vontuk ki a miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével a gyártó utasításai szerint, beleértve az elúciós lépés inkubációs idejét is.Az RNS-koncentrációt NanoDrop 2000 spektrofotométeren határoztuk meg.Az RNS microarray minőségét Agilent 2100 bioanalizátorral (Agilent Technologies, Amstelveen, Hollandia) értékeltük.
10% exoszómaszegény FBS-t tartalmazó DMEM-et 100 000 g-vel 16 órán át 4 °C-on végzett ultracentrifugálással állítottunk elő, és 0,22 µm-es szűrőn (Nalgene, Rochester, NY, USA) szűrtük.5 × 105 BV2 sejteket tenyésztettünk 10% exoszómától mentesített FBS-t és 1% antibiotikumot tartalmazó DMEM-ben 37 °C-on és 5% CO2-on.24 órás inkubáció után az RH vagy ME49 törzs tachyzoitjait (MOI = 10) adtuk a sejtekhez, és a nem behatoló parazitákat egy órán belül eltávolítottuk, és újratöltöttük DMEM-mel.A BV2 sejtekből származó exoszómákat módosított differenciálcentrifugálással, a legszélesebb körben alkalmazott módszerrel izoláltuk.Szuszpendálja újra az exoszóma pelletet 300 µl PBS-ben RNS- vagy fehérjeanalízishez.Az izolált exoszómák koncentrációját BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA) és NanoDrop 2000 spektrofotométer segítségével határoztuk meg.
A BV2 sejtekből származó csapadékot vagy a BV2-ből származó exoszómákat PRO-PREP™ fehérje extrakciós oldatban (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) lizáltuk, és a fehérjéket Coomassie briliánskékkel festett 10%-os SDS poliakrilamid gélekre töltöttük.Ezenkívül a fehérjéket PVDF membránokra vittük át 2 órára.A Western-blotokat az Alix antitesttel (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) exoszomális markerként validáltuk.Másodlagos antitestként HRP-konjugált kecske anti-egér IgG-t (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) és LAS-1000 plusz lumineszcens képelemzőt (Fuji Photography Film, Tokió, Japán) használtunk..Transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgálták az exoszómák méretét és morfológiáját.A BV2 sejtekből izolált exoszómákat (6,40 µg/µl) szénnel bevont hálókra készítettük, és 2%-os uranil-acetáttal 1 percig negatívan festettük.Az elkészített mintákat ES1000W Erlangshen CCD kamerával (Gatan, Pleasanton, CA, USA) felszerelt JEOL 1200-EX II (Tokió, Japán) 80 kV-os gyorsítófeszültségen figyeltük meg.
A BV2-eredetű exoszómákat PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) segítségével festettük szobahőmérsékleten 15 percig.U87 sejteket, 2 × 105, negatív kontrollként PKH26-tal jelölt exoszómákkal (piros) vagy exoszómák nélkül, 37 °C-on 24 órán át inkubáltuk 5% CO2 inkubátorban.Az U87 sejtmagokat DAPI-val (kék) festettük, az U87 sejteket 4%-os paraformaldehidben fixáltuk 15 percig 4°C-on, majd Leica TCS SP8 STED CW konfokális mikroszkóp rendszerben (Leica Microsystems, Mannheim, Németország) analizáltuk.megfigyelhető.
A cDNS-t siRNS-ből szintetizáltuk Mir-X siRNS első szál szintézissel és SYBR qRT-PCR kittel (Takara Bio Inc., Shiga, Japán).A valós idejű kvantitatív PCR-t az iQ5 valós idejű PCR detektáló rendszerrel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) végeztük, SYBR Premix-szel kevert primerek és templátok felhasználásával.A DNS-t 40 denaturációs cikluson keresztül amplifikáltuk 95 °C-on 15 másodpercig, majd 60 °C-on 60 másodpercig.Az egyes PCR-reakciók adatait az iQ™5 optikai rendszerszoftver (Bio-Rad) adatelemző moduljával elemeztük.A génexpresszió relatív változásait a kiválasztott célgének és a β-aktin/siRNS (és az U6) között standard görbe módszerrel számítottuk ki.A használt primer szekvenciákat az 1. táblázat tartalmazza.
3 x 104 U87 glióma sejtet oltottunk 96 lyukú lemezekre, és összekevertük a BV2-ből származó Toxoplasma-fertőzött exoszómákkal (50 μg/ml) vagy a BV2-ből származó nem pulzusos exoszómákkal (50 μg/ml) kontrollként 12, 18 és 36 órában. .A sejtproliferáció sebességét a Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japán) segítségével határoztuk meg (S1-S3 kiegészítő ábrák)46.
5 hetes nőstény BALB/c csupasz egereket az Orient Bio-tól (Seongnam-si, Dél-Korea) vásároltunk, és egyenként steril ketrecekben tartottuk szobahőmérsékleten (22±2°C) és páratartalom mellett (45±15°C).%) szobahőmérsékleten (22±2°C) és páratartalom mellett (45±15%).Egy 12 órás fényciklust és egy 12 órás sötét ciklust végeztek SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center) alatt.Az egereket véletlenszerűen három, egyenként 5 egérből álló csoportra osztottuk, és mindegyik csoportot szubkután injektáltuk 400 ml PBS-sel, amely 1 x 107 U87 glióma sejtet és növekedési faktorral csökkentett BD Matrigel™-et (BD Science, Miami, FL, USA) tartalmazott.Hat nappal a tumor injektálása után 200 mg BV2 sejtekből származó exoszómát (toxoplazma fertőzéssel vagy anélkül) injektáltunk a tumor helyére.Huszonkét nappal a daganatfertőzés után minden csoportban hetente háromszor mértük meg tolómérővel a daganat méretét, és a tumor térfogatát a következő képlettel számítottuk ki: 0,5×(szélesség)×2×hossz.
MikroRNS expressziós elemzés miRCURYTM LNA miRNS tömb segítségével, 7. generáció rendelkezik, mmu és rno tömbökkel (EXIQON, Vedbaek, Dánia), amely 1119 jól jellemzett egeret fed le 3100 humán, egér és patkány miRNS befogó szonda közül.Az eljárás során 250-1000 ng teljes RNS-t távolítottak el az 5'-foszfátból borjúbél alkalikus foszfatázzal történő kezelésével, majd Hy3 zöld fluoreszcens festékkel történő jelöléssel.A jelölt mintákat ezután hibridizáltuk microarray tárgylemezek betöltésével, hibridizációs kamrakészlettel (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) és hibridizációs tárgylemezkészlettel (Agilent Technologies).A hibridizációt 16 órán keresztül 56°C-on végeztük, majd a mikrotömböket a gyártó ajánlása szerint mostuk.A feldolgozott microarray tárgylemezeket ezután Agilent G2565CA microarray szkenner rendszerrel (Agilent Technologies) szkenneltük.A beszkennelt képeket az Agilent Feature Extraction szoftver 10.7.3.1-es verziójával (Agilent Technologies) importáltuk, és az egyes képek fluoreszcencia intenzitását a módosított Exiqon protokoll megfelelő GAL fájljával számszerűsítettük.A jelenlegi vizsgálat Microarray adatai a GEO adatbázisban vannak elhelyezve GPL32397 nyilvántartási számon.
Az érett exoszomális miRNS-ek expressziós profilját Toxoplasmával fertőzött RH vagy ME49 törzsek mikrogliáiban különböző hálózati eszközök segítségével elemeztük.A tumorfejlődéssel összefüggő miRNS-eket a miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) segítségével azonosítottuk, és 8,0-nál nagyobb normalizált jelintenzitással (log2) szűrtük ki.A miRNS-ek közül a T. gondii-vel fertőzött RH vagy ME49 törzsek által módosított miRNS-ek szűrőelemzése alapján a differenciálisan expresszált miRNS-ek több mint 1,5-szeres változást mutattak.
A sejteket hatlyukú lemezekre oltottuk (3x105 sejt/lyuk) opti-MEM-ben (Gibco, Carlsbad, CA, USA) Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) alkalmazásával.A transzfektált sejteket 6 órán át tenyésztettük, majd a tápközeget friss komplett táptalajra cseréltük.A sejteket 24 órával a transzfekció után gyűjtöttük össze.
A statisztikai elemzést főként Student-féle t-teszttel végeztük Excel szoftverrel (Microsoft, Washington, DC, USA).A kísérleti állatanalízishez kétirányú ANOVA-t végeztünk Prism 3.0 szoftverrel (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). A 0,05-nél kisebb P-értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. A 0,05 alatti P-értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. A 0,05 alatti P értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义. P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. A 0,05 alatti P értékeket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.
A tanulmányban használt összes kísérleti protokollt a Szöuli Nemzeti Orvostudományi Egyetem intézményi felülvizsgálati bizottsága hagyta jóvá (IRB szám: SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Becsült globális rákos megbetegedések és halálozások 2018-ban: GLOBOCAN források és módszerek.Értelmezés.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Betekintés az agydaganatok kockázati tényezőibe és terápiás beavatkozásaikba. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Betekintés az agydaganatok kockázati tényezőibe és terápiás beavatkozásaikba.Rashid, S., Rehman, K. és Akash, MS Az agydaganatok és a főbb terápiás beavatkozások kockázati tényezőinek áttekintése. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Az agydaganat kockázati tényezőinek és terápiás beavatkozásainak mély ismerete.Rashid, S., Rehman, K. és Akash, MS Az agydaganatok és a főbb terápiás beavatkozások kockázati tényezőinek áttekintése.Orvosbiológiai tudomány.Gyógyszerész.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriális-vírus interakciók humán orodigestive és női nemi traktus rákos megbetegedéseiben: Epidemiológiai és laboratóriumi bizonyítékok összefoglalása. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakteriális-vírus interakciók humán orodigestive és női nemi traktus rákos megbetegedéseiben: Epidemiológiai és laboratóriumi bizonyítékok összefoglalása.Kato I., Zhang J. és Sun J. Bakteriális-vírus kölcsönhatások az emberi gyomor-bél traktus és a női nemi traktus rákos megbetegedésében: epidemiológiai és laboratóriumi adatok összefoglalása. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-vírus kölcsönhatás az emberi szájüreg emésztésében és a női reproduktív traktusban: a népbetegségtudomány és a laboratóriumi bizonyítékok összefoglalása.Kato I., Zhang J. és Sun J. Bakteriális-vírus kölcsönhatások humán gyomor-bélrendszeri rákban és női nemi szervrákban: epidemiológiai és laboratóriumi adatok összefoglalása.Cancer 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL A fertőzéstől a rákig: Hogyan változtatják meg a DNS-tumorvírusok a gazdasejt központi szén- és lipidanyagcseréjét. Magon, KL & Parish, JL A fertőzéstől a rákig: Hogyan változtatják meg a DNS-tumorvírusok a gazdasejt központi szén- és lipidanyagcseréjét.Mahon, KL és Parish, JL Tűzfertőzés a rákba: hogyan változtatják meg a DNS-alapú daganatvírusok a gazdasejt központi szén- és lipidanyagcseréjét. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNS 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质仂 Magon, KL & Parish, JL A fertőzéstől a rákig: hogyan változtatják meg a DNS-tumorvírusok a gazdasejt központi szén- és lipidanyagcseréjét.Mahon, KL és Parish, JL. A rák fertőzése: hogyan változtatják meg a DNS-tumorvírusok a központi szén- és lipidanyagcserét a gazdasejtekben.Nyílt biológia.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.A schistoszómák és a májmételyek katekol ösztrogének és a helminth-asszociált rák.elülső.forró belül.5, 444 (2014).