A Giardia duodenum egy parazita organizmus, amely giardiasist okoz, egy bélfertőzést, amely különösen gyakori a hasmenés klinikai tüneteit mutató kisgyermekeknél.Korábban már beszámoltunk arról, hogy az extracelluláris G. duodenalis kiváltja az intracelluláris oligomerizációhoz hasonló receptor 3 (NLRP3) kötő nukleotidok aktiválását, és szabályozza a gazdaszervezet gyulladásos válaszait az extracelluláris vezikula (EV) szekréción keresztül.Azonban a folyamatban részt vevő kórokozó-asszociált duodenococcus EV (GEV) pontos molekuláris mintázata és az NLRP3 gyulladásos szerepe a giardiasisban még tisztázásra vár.
A GEV-ben található pcDNA3.1(+)-alfa-2 és alfa-7.3 giardinok rekombináns eukarióta expressziós plazmidjait megszerkesztettük, egér primer peritoneális makrofágokba transzfektáltuk, és a gyulladásos célmolekula kaszpáz-1 mérésével detektáltuk.A p20 expressziós szintet szűrtük..A G. duodenalis alfa-2 és alfa-7.3 giardinokat eredetileg NLRP3 inflammaszóma (NLRP3, pro-interleukin-1 béta [IL-1β], pro-kaszpáz-1 és kaszpáz-1 p20), IL-szekréció mérésével azonosították.1β szintek, apoptotikus foltos fehérje (ASC) oligomerizációs szintjei, valamint az NLRP3 és ASC immunfluoreszcens lokalizációja.Az NLRP3 inflammaszóma szerepét a G. duodenalis patogenitásában ezután olyan egerek segítségével értékelték, amelyekben az NLRP3 aktivációt blokkolták (NLRP3 blokkolt egerek), és monitorozták a testtömegben, a nyombél parazita terhelésében és a nyombélszövetben bekövetkező patológiás változásokat.Emellett megvizsgáltuk, hogy az alfa-2 és alfa-7.3 hiardinek indukálnak-e IL-1β szekréciót in vivo az NLRP3 gyulladáson keresztül, és meghatároztuk ezeknek a molekuláknak a szerepét a G. duodenalis patogenitásában egerekben.
Az alfa-2 és alfa-7.3 giardinek in vitro indukálják az NLRP3 inflammaszóma aktiválását.Ez a p20 kaszpáz-1 aktiválásához, az NLRP3, pro-IL-1β és pro-kaszpáz-1 fehérjék expressziós szintjének növekedéséhez, az IL-1β szekréció jelentős növekedéséhez, ASA foltok kialakulásához vezetett a citoplazma és az ASA oligomerizáció indukciója.NLRP3 gyulladás A pénisz elvesztése súlyosbítja a G. duodenalis patogenitását egerekben.Az NLRP3-blokkolt egerekből származó szondán keresztül cisztákkal kezelt egerekben megnövekedett a trofozoiták száma és a nyombélbolyhok súlyos károsodása, amelyet zsugorodott és elágazó nekrotikus kripták jellemeztek.In vivo kísérletek kimutatták, hogy az alfa-2 és alfa-7.3 giardinok IL-1β szekréciót indukálhatnak az NLRP3 gyulladáson keresztül, és az alfa-2 és alfa-7.3 giardinokkal végzett immunizálás csökkentette a G. duodenalis patogenitását egerekben.
Összességében ennek a tanulmánynak az eredményei azt sugallják, hogy a giardia alfa-2 és alfa-7.3 a gazdaszervezet NLRP3 gyulladásának fokozódását okozza, és csökkenti a G. duodenalis fertőzőképességét egerekben, amelyek ígéretes célpontok a giardiasis megelőzésében.
A Giardia duodenum egy extracelluláris protozoon parazita, amely a vékonybélben él, és évente 280 millió giardiasist okoz hasmenéssel, különösen a fejlődő országok kisgyermekeinél [1].Az emberek ivóvíztől vagy M. duodenum cisztákkal szennyezett élelmiszerektől fertőződnek meg, amelyek ezután bejutnak a gyomorba, és a gyomornedvekkel ürülnek ki.A Giardia duodenum trophozoiták a nyombélhámhoz kötődnek, hányingert, hányást, hasmenést, hasi fájdalmat és súlycsökkenést okozva.Az immunhiányos és cisztás fibrózisban szenvedő egyének érzékenyek a fertőzésekre.A fertőzés orális és anális szex során is előfordulhat [2].Az olyan gyógyszerek, mint a metronidazol, a tinidazol és a nitazoxanid a nyombélfertőzések előnyös kezelési lehetőségei [3].Ezek a kemoterápiás gyógyszerek azonban káros mellékhatásokat okoznak, például hányingert, karcinogenezist és genotoxicitást [4].Ezért hatékonyabb stratégiákat kell kidolgozni a G. duodenalis fertőzés megelőzésére.
Az inflammaszómák a citoszolos fehérjekomplexek egy osztálya, amelyek a veleszületett immunválasz részét képezik, segítik a kórokozók inváziója elleni védekezést és közvetítik a gyulladásos válaszokat [5].Ezek közül a gyulladások közül a nukleotid-kötő oligomerizáció (NOD) receptor 3 (NLRP3) nukleotid-kötő oligomerizáció (NLRP3) nukleotid-kötőszerű gyulladást alaposan tanulmányozták, mivel különböző kórokozókkal/károsodással összefüggő molekuláris mintákkal (PAMP/) kimutatható. DAMP), felismeri, aktiválja a veleszületett immunrendszert.és számos gyulladásos betegségben szabályozza a bél homeosztázist [6,7,8].A mintázatfelismerő receptor (PRR) NLRP3, egy adapter apoptotikus foltos fehérje (ASC) és egy effektor procaspase-1 vagy procaspase-11.A Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] és Leishmania tanulmányok szerint az NLRP3 inflammaszóma gazdaszervezetként működik a kórokozók inváziója ellen.[11], de arról is beszámoltak, hogy az NLRP3 gyulladásos aktiválódása korlátozza a védő immunválaszokat és súlyosbítja a betegség progresszióját, például férgek esetében [12].Korábbi eredményeink alapján beszámoltunk arról, hogy az extracelluláris G. duodenalis kiváltja az NLRP3 gyulladás intracelluláris aktivációját, és az extracelluláris vezikulák (EV-k) kiválasztásával modulálja a gazdaszervezet gyulladásos válaszait [13].Azonban az NLRP3 inflammaszóma szerepe a G. duodenalis fertőzésben in vivo még tisztázásra vár.
A giardinokat eredetileg a G. duodenalis citoszkeleton szerkezeti alkotóelemeiként írták le, és fontos szerepet játszanak a trofozoitok mozgékonyságában és a vékonybélben a hámsejtek kötődésében.A környezethez való jobb alkalmazkodás és patogenitásuk növelése érdekében a G. duodenalis trophozoites egyedülálló citoszkeletális szerkezetet fejlesztett ki, amely 8 flagellából, 1 középtestből és 1 ventrális lemezből állt [14].A Giardia duodenum trofozoitái citoszkeletonjuk segítségével behatolnak a vékonybél felső részébe, különösen a nyombélbe, és az enterocitákhoz kötődnek.Folyamatosan vándorolnak, és sejtanyagcsere segítségével kötődnek a hámsejtekhez.Ezért szoros kapcsolat van a citoszkeleton és a virulencia között.A Giardia duodenumra specifikus giardinek a citoszkeleton szerkezetének alkotóelemei [15], és négy osztályba sorolhatók: α-, β-, γ- és δ-giardinek.Az α-giardin családnak 21 tagja van, amelyek mindegyike kalcium-függő képességgel rendelkezik a foszfolipidek megkötésére [16].Ezenkívül összekötik a citoszkeletont a sejtmembránnal.A G. duodenalis által okozott hasmenésben szenvedő egyénekben az α-giardinok erősen expresszálódnak és immunreaktívak a fertőzés során [17].A Giardia alfa-1 alapú heterológ vakcinák egerekben védelmet nyújtottak a giardiasis ellen, és potenciális antigének jelöltek a vakcina kifejlesztésében [18].Az alfa-8 giardin, amely a plazmamembránban és a flagellában lokalizálódik, de nem a ventrális porckorongban, fokozza a trophozoiták mozgékonyságát és növekedési sebességét G. duodenalisban [19].Az alfa-14 giardin a flagellák mikrotubulus-struktúráihoz kötődik, és befolyásolja a G. duodenalis életképességét [20].Az alfa-11 giardin bőségesen van jelen az életciklus során, és az alfa-11 giardin túlzott expressziója magát a G. duodenalis-t károsítja [21].Nem világos azonban, hogy az alfa-2-giardin és az alfa-7,3-giardin védelmet nyújt-e a G. duodenalis fertőzéssel és az ezek mögött meghúzódó mechanizmusokkal szemben.
Ebben a vizsgálatban a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine és a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardine rekombináns eukarióta expressziós plazmidokat egér primer hashártya makrofágokba transzfektáltuk, hogy aktiváljuk a gazda NLRP3-at.A gyulladásos célpontokat ezután szűrték.Felmértük az NLRP3 gyulladás szerepét a G. duodenalis patogenitásában, megvizsgáltuk, hogy az alfa-2 és alfa-7,3 giardinek indukálják-e az NLRP3 gyulladást in vivo, és megállapítottuk, hogy a giardinek e két szerepe a patogenitásban G. duodenalis.Közös célunk az volt, hogy ígéretes célpontokat dolgozzunk ki a G. duodenalis fertőzés megelőzésére.
Vad típusú (WT) C57BL/6 5-8 hetes nőstény egereket a Liaoning Changsheng Experimental Animal Centertől (Liaoning, Kína) vásároltunk.Az egerek szabadon hozzáférhettek a vízhez, sterilizált táplálékot kaptak, és 12/12 órás világos/sötét ciklusban tartották őket.A fertőzés előtt az egerek ad libitum antibiotikumot kaptak ampicillinnel (1 mg/ml), vankomicinnel (1 mg/ml) és neomicinnel (1,4 mg/ml) kiegészített ivóvízben (mindegyik Sanghajból (Kína, mesterséges organizmusok) vásárolt) [22] ].].Azokat az egereket, amelyek több mint 24 órán keresztül elvesztették az evés- és ivásképességüket, és ≥ 20%-ot veszítettek testsúlyukból, humánus módon elaltatták nyaki diszlokációval.
A WB G. duodenalis trophozoitákat (American Type Culture Collection, Manassas, USA) 12,5% magzati szarvasmarha szérummal (FBS; Every Green, Zhejiang, Kína) és 0,1% szarvasmarha epével (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) egészítettük ki. ).USA) mikroaerob körülmények között.Az összefolyó trofozoitokat jégen gyűjtöttük össze, és 1:4 arányban passzáltuk a további szaporodás érdekében.
A Giardia duodenum cisztákat a korábban leírtak szerint indukáltuk [23], a trofozoitokat logaritmikus fázisban gyűjtöttük be, majd kapszulázást indukáló tápközeggel, pH 7,1 (módosított TYI-S-33) 1 × 106 trofozoit/ml végső koncentrációra hígítottuk.epekoncentráció 0,05% közeg).A trofozoitokat anaerob körülmények között tenyésztettük 37 °C-on a logaritmikus növekedési fázisig.Cserélje ki a tápközeget ciszta-indukáló tápközegre (pH 7,8; ​​módosított TYI-S-33 táptalaj 1% epekoncentrációval), és tenyésztse a G. duodenalis-t 37°C-on 48-96 órán keresztül, amely alatt mikroszkóp alatt megfigyelték a ciszták képződését.Miután a trofozoiták többségét ciszták képződésére indukáltuk, a tenyészetet összegyűjtöttük, és steril ionmentes vízben újraszuszpendáltuk, hogy a maradék trofozoitokat lizáljuk.A cisztákat megszámoltuk és 4 °C-on tároltuk a későbbi elemzésekhez gyomorszondán keresztül egerekben.
A Giardia extracelluláris vezikulumokat (GEV) a korábban leírtak szerint dúsították [13].A logaritmikus növekedési fázisban lévő trofozoitokat exoszómáktól mentesített FBS-sel (Biological Industries, Beit-Haemek, Izrael) készített módosított TYI-S-33 táptalajban 1 × 106 parazita/ml végső koncentrációig szuszpendáltuk, és 12 órán át inkubáltuk.A tenyészet felülúszójából centrifugálással izoláltuk 2000 g-vel 10 percig, 10 000 g-vel 45 percig és 100 000 g-vel 60 percig.A csapadékot foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) oldottuk, mennyiségileg meghatároztuk egy BCA protein vizsgálati készlettel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), és -80 °C-on tároltuk, vagy közvetlenül felhasználtuk további elemzésekhez.
Az elsődleges egér peritoneális makrofágokat a korábban leírtak szerint állítottuk elő [24].Röviden, az egereket (6-8 hetes) injektáltuk (intraperitoneálisan [ip]) 2,5 ml 2,98%-os Difco folyékony tioglikol tápközeggel (BD, Franklin Lakes, NJ, USA), és 3-4 szájpadlást etettünk.Eutanázia után makrofágszuszpenziót gyűjtöttünk az egerek hasüregéből, és 3-szor centrifugáltuk 1000 g-vel 10 percig.Az összegyűjtött sejteket áramlási citometriával detektáltuk CD11b marker alkalmazásával, amíg a sejttisztaság >98% nem lett, majd 6 lyukú sejttenyésztő lemezekre adtuk (4,5 x 106 sejt/lyuk), és 10% FBS-sel (Bioindustry) inkubáltuk 37 °C-on.és 5% CO2.
Az RNS-t 1 × 107 trofozoitból extraháltuk 1 ml TRIzol reagensben (Vazyme, Nanjing, Kína), a genomiális DNS-t a teljes G. duodenalis RNS-ből vontuk ki MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Kína) segítségével, és komplementer DNS-t (cDNS) szintetizáltunk. MonScript RTIIII Super Mix (Monad) használatával a gyártó utasításai szerint.
A cél G. duodenalis gén CDS szekvenciáját az NCBI GenBank-tól szereztük be.Használja a Primer 5.0-t, hogy minden egyes célgénhez specifikus zökkenőmentes klónozó primereket tervezzen.A forward primer (5'-3') három részből áll: egy átfedő szekvenciából egy linearizált pcDNA3.1(+) EcoRV vektorral (TGGTGGAATTCTGCAGAT) és az ATG és GNN startkodonokkal (ha az első bázis nem G).Ez a kifejezés hatékonyságának javítása érdekében történik.Ezenkívül legalább 16 bp kombinált bázisok (GC tartalom 40-60%/Tm kb. 55 °C).A fordított primer (5'-3') két részből áll, egy átfedő szekvenciából egy EcoRV-linearizált pcDNA3.1(+) vektorral (GCCGCCACTGTGCTGGAT) és egy legalább 16 bp méretű kombinált bázisból.(az utolsó két megálló nélkül).bázisok) egy kodon, például AA vagy GA, amely lehetővé teszi a rekombináns plazmidok számára, hogy kifejezzék jelölt fehérjeiket).A primer szekvenciákat az 1. táblázat tartalmazza, és a Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kína) szintetizálta.
A célpontokat Pfu DNS polimeráz (Tiangen, Peking, Kína) vagy Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Peking, Kína) alkalmazásával amplifikáltuk, templátként elkészített G. duodenalis cDNS-t használva.A pcDNA3.1(+) eukarióta expressziós vektor plazmidot EcoRV restrikciós enzimmel linearizáltuk, és Fast AP (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával defoszforileztük.A linearizált pcDNA3.1(+) fragmentumokat és az amplifikált célgén-fragmenseket DNS-géltisztító készlettel (Tiangen) tisztítottuk, és Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific) alkalmazásával mennyiségileg meghatároztuk.A pcDNA3.1(+) fragmenst és mindegyik célgén-fragmenst MonClone egyetlen összeállítású klónozási keverékkel (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Kína) rekombináltuk, és DNS-szekvenálással igazoltuk a Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Kína) alkalmazásával..
A pcDNA3.1(+)-alpha-2 és pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 endotoxin-mentes plazmidokat a SanPrep Endotoxin-mentes Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech) segítségével állítottuk elő.A koncentrációt 500 ng/µl felett tartottuk annak biztosítására, hogy az elúciós pufferben lévő EDTA ne zavarja a transzfekciós vizsgálatot.Az elsődleges egér peritoneális makrofágokat 6 lyukú lemezeken tenyésztettük komplett RPMI 1640 tápközeggel (Biological Industries) 12 órán át, majd a sejteket háromszor mostuk meleg PBS-ben a penicillin és a sztreptomicin eltávolítása érdekében, majd komplett tápközeggel kiegészített tápközegben.Az endotoxin-mentes pcDNA3.1(+)-alpha-2 és pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) plazmidokat 125 μl Opti-MEM redukált szérum tápközegben (Gibco, Thermo Fisher Scientific) hígítottuk..Ezután 5 µl Lipofectamine 2000 transzfekciós reagenst (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) 125 µl alacsony szérumtartalmú Opti-MEM tápközegben hígítottunk.Liposzóma-DNS komplexeket készítsen úgy, hogy a hígított endotoxin-mentes plazmidot összekeverjük Lipofectamine 2000-nel, és hagyjuk a keveréket szobahőmérsékleten 5 percig állni.A komplexeket külön-külön vigye át minden egyes üreg sejtjébe, és lassan keverje össze.4 óra elteltével a sejttenyésztő tápközeget 2 ml komplett RPMI 1640 táptalajra cseréltük, és a tenyésztést 24 órán át folytattuk.Friss sejttenyésztő tápközeget adtunk a sejtekhez, és a vizsgálati tervtől függően különböző időpontokig inkubáltuk.
A felülúszókból és sejtlizátumokból származó fehérjemintákat a korábban leírtak szerint készítettük [25].A pro-IL-1β, pro-kaszpáz-1, kaszpáz-1 p20, NLRP3, β-aktin és His-tag membrántranszfer paraméterei 200 mA/90 perc voltak.Az interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), a kaszpáz-1 (p20) (Adipogen, Svájc) és az NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Svájc) és az 1:5000 His tagot célzó 1:5000 esetében (Amylet Scientific) Wuhan, Kína) és β-aktin (Proteintech, Wuhan, Kína).
A diszzukcinimid-suberáttal (DSS) való keresztkötést a korábban leírtak szerint végeztük [26].A sejteket háromszor mostuk hideg PBS-sel, és teljesen lizáltuk egy 27 gauge tűvel 50 µl ASC reakciópufferben (pH 8,0), amely 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES és 125 mM NaHC03 volt.Az elegyet 5000 g-vel centrifugáltuk 3 percig, és a pelletet 10 µl DSS-sel (25 mM DMSO-ban) és 40 µl ASC reakciópufferrel varrtuk 30 percig 37 °C-on.5000 g-vel 10 percig végzett centrifugálás után a pelletet feloldottuk 40 µl ASC reakciópuffer és 10 µl 6x fehérjefeltöltő puffer (TransGen, Peking, Kína) oldatában, majd az oldatot szobahőmérsékleten 15 percig leállítottuk. min., Ezután forraljuk 10 percig.A fehérjemintákat ezután Western-blot-vizsgálatnak vetettük alá primer anti-ASC antitestekkel (Wanleibio, Shenyang, Kína) 1:500 hígítási arány mellett.
Egy korábban leírt eljárást követve [13] a sejttenyészet felülúszóit összegyűjtöttük, és az IL-1β gyulladást elősegítő citokin szekrécióját egér IL-1 Beta ELISA kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) segítségével határoztuk meg.Konvertálja az OD450nm értékeket fehérjekoncentrációkká az IL-1β standard görbe segítségével.
A fedőlemezekre bevont sejteket háromszor óvatosan mostuk meleg PBS-ben, szövetsejt-fixálóban (Biosharp, Peking, Kína) fixáltuk 10 percig szobahőmérsékleten (RT), 0,1%-os Triton X-Permeabilize-ben 100 °C-on (PBS-ben hígítva; Biosharp). ) 20 percig szobahőmérsékleten, majd blokkoljuk 5%-os szarvasmarha-szérumalbuminban (PBS-ben) 2 órán át szobahőmérsékleten.Ezután a sejteket egy éjszakán át 4 °C-on ASC (1:100 hígítás) vagy NLRP3 (1:100 hígítás), illetve Cy3-mal jelölt kecske anti-nyúl IgG(H+L) (1:400; EarthOx) elleni primer antitestekkel inkubáltuk. , San Francisco, CA, USA) vagy FITC-konjugált kecske anti-egér IgG-vel (1:400; Earthox) egy éjszakán át 37 °C-on, sötétben 1 órán át.A sejtmagokat Hoechst 33258-cal (10 μg/ml; UE, Suzhou, Kína) festettük 5 percig, és fluoreszcens mikroszkóp alatt figyeltük meg (Olympus Corporation, Tokió, Japán).
Az egereket négy csoportra osztották (n = 7 mindegyik csoportban): (i) PBS-sel kezelt negatív kontrollcsoport (csak PBS; szondán át 100 µl/egér PBS, majd napi 100 µl/egér PBS intraperitoneális injekció 3 órával később)., folyamatosan 7 napig);(ii) MCC950-inhibitorral kezelt negatív kontrollcsoport [27] (100 µl/egér PBS-szondán keresztül, 3 órával később, 10 mg/testtömeg-kg [BW] MCC950-et [PBS-ben] adtunk intraperitoneálisan naponta, időtartama 7 nap);(iii) G. duodenalis ciszta fertőzéses csoport (1,5 x 106 ciszta/egér szondán keresztül, 3 órával később, 100 μl/egér PBS intraperitoneálisan, naponta 7 napon keresztül);(iv) G. duodenalis ciszta kombinált fertőzési csoport MCC950 inhibitorral kezelt csoport (1,5 × 106 ciszta/egér szondán keresztül, 10 mg/ttkg MCC950 intraperitoneálisan naponta 7 napon keresztül, 3 órával).Minden egyes egér testtömegét naponta ellenőriztük, és a 7. napon minden egeret elaltattunk.A betakarított duodenumot (3 cm hosszú) apró darabokra vágtuk 1 ml PBS-ben, a cisztákat egy éjszakán át 4 °C-os PBS-ben elpusztítottuk, és a G. duodenalis trophozoitákat.Friss duodenumot (1 cm hosszú) izoláltunk hematoxilin és eozin (H&E) festéshez.
Az egereket két csoportra osztották: (i) MOCK kontrollcsoportra és (ii) MCC950 inhibitor csoportra.Mindegyik csoportban öt kezelés történt (n = 7/kezelt csoport): (i) PBS-kezelés negatív kontrollcsoport (csak PBS; 100 µl/egér PBS, intramuszkuláris (IM) injekció (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plazmid negatív kontrollcsoport (100 µg/egér DNS, intramuszkuláris injekcióval (iii) G. duodenalis ciszta fertőzés pozitív kontrollcsoport (1,5 x 106 ciszta/egér, szondán keresztül) (iv) a); a pcDNA3.1(+)-alfa-2 plazmiddal kezelt csoport (100 µg/egér DNS, intramuszkuláris injekcióval), és (v) a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 plazmiddal (100 µg/egér) kezelt csoport A DNS-t 12 órás átoltás után az MCC950 inhibitor csoportba tartozó egerek naponta intraperitoneális MCC950 injekciót (10 mg/ttkg) kaptak 7 napon keresztül, míg a MOCK csoport egerei azonos térfogatú PBS kezelést kaptak. A vérmintákat A szérummintákat a szemgolyó egerekből gyűjtöttük össze, és egy éjszakán át 4 °C-on hagytuk.
Harmincöt egeret öt csoportra osztottak (n=7/csoport).Az 1. csoport PBS-sel kezelt negatív kontrollcsoport volt: az egerek 100 μl PBS-t kaptak intramuszkulárisan, majd 3 nappal később szondán keresztül.A 2. csoport egy G. duodenalis cisztákkal fertőzött pozitív kontrollcsoport: az egerek 100 μl PBS-t, majd 3 nappal később 1,5 x 106 ciszta/egér intragasztrikus injekciót kaptak.Harmadik csoport – plazmidimmunizálás pcDNA3.1(+)-val kombinálva a nyombélciszta fertőzés kontrollcsoportjával: az egerek 100 μg pcDNA3.1(+)(im) plazmid DNS-t kaptak szájon át, 1,5×106 ciszta/egér 3 több alkalommal napok.A 4. és 5. csoport rekombináns pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin plazmid vagy pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin plazmid, G. duodenalis ciszta fertőzéssel kombinálva.Kísérleti csoport: az egerek 100 µg pcDNA3-at kaptak.1(+)-giardin plazmid DNS-t (im), majd 3 nappal később 1,5 × 106 cisztát injektáltunk be szondán keresztül.Az egyes egerek testtömegét a G. duodenalis ciszta csövön keresztüli bevezetése után követtük.Friss duodenumot gyűjtöttünk a parazita terhelés mérésére és a HE festés elemzésére.
A hisztopatológiai elváltozásokat egy korábban publikált eljárás szerint elemeztük [30].A friss duodenumot szövetsejt-fixálóval rögzítettük, paraffinba ágyaztuk, 4 μm-es metszetekre vágtuk, H&E-vel megfestettük és fénymikroszkóp alatt elemeztük.Hét független egérből származó hét szövetmetszet reprezentatív patológiás elváltozásait értékelte egy patológus, aki nem tudott a kezelésről, és 200-szoros nagyítással rögzítették.A bolyhok hosszát és a kripták mélységét a korábban ismertetett módszerekkel mértük.
Az in vitro és in vivo eredményeket három párhuzamosban kaptuk.A grafikonok a GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) segítségével készültek.A két csoport közötti különbségeket t-próbával, míg a ≥3 csoport közötti különbségeket egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük SPSS szoftver (22.0 verzió; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA) segítségével.Az adatokat a variancia homogenitása szempontjából Levene teszttel, majd Bonferroni post hoc teszttel (B) elemeztük.A szignifikancia P<0,05, P<0,01 és P<0,001 (nem szignifikáns [ns]) formában van kifejezve (P>0,05).
A Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) GEV proteomikájának korábbi elemzése kimutatta, hogy számos célpont szerepet játszhat a gyulladásos jelátviteli útvonalak aktiválásában [13].Kiválasztottunk két ígéretes célpontot, az alfa-2 és alfa-7.3 giardint, ezeket a molekulákat amplifikáltuk és felhasználtuk a pcDNA3.1(+) eukarióta expressziós vektor megalkotására.A szekvenálás után a rekombináns pcDNA3.1(+)-alfa-2 és alfa-7.3 giardin expressziós plazmidokat primer egér peritoneális makrofágokba transzfektáltuk, és azonosítottuk a gyulladás kaszpáz-1 p20 aláírási fehérjét (az aktivált kaszpáz-1 fragmensét). mint a gyulladást kiváltó kulcsmolekulák feltárása.Az eredmények azt mutatták, hogy az alfa-2 és alfa-7.3 giardinek a GEV-hez hasonló p20 kaszpáz-1 expressziót indukálhatnak.Nem találtunk hatást a kaszpáz-1 aktiválására a kezeletlen negatív kontrollban (csak PBS) és a plazmid kontroll pcDNA3.1(+)-ban (1. ábra).
A p20 kaszpáz-1 aktiválásának mérése pcDNA3.1(+)-alfa-2 és alfa-7.3 giardinokkal.A pcDNA3.1(+)-alfa-2 és alfa-7.3 giardinok rekombináns eukarióta expressziós plazmidjait (mindegyik sáv felett) primer egér peritoneális makrofágokba transzfektáltuk, és a tenyészet felülúszóit 24 órával később összegyűjtöttük.Western blottingot használtunk a kaszpáz-1 p20 gyulladásos fehérje expressziós szintjének mérésére.Negatív kontrollként a csak PBS-sel kezelt csoportot (C sáv) és pcDNA3.1(+) monoterápiás csoportot (pcDNA3.1 sáv), pozitív kontrollként a GEV kezelési csoportot alkalmaztuk.A rekombináns fehérje expresszióját úgy igazoltuk, hogy mindegyik fehérjében egy hisztidin jelölést detektáltunk, és a várt fehérjesávok az alfa-2 giardin (38,2 kDa) és az alfa-7,3 giardin (37,2 kDa) voltak.GEV, Giardia duodenum extracelluláris vezikulák, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearizált vektor, SUP, felülúszó
Annak meghatározására, hogy az alfa-2 giardin és az alfa-7.3 giardin indukál-e p20 kaszpáz-1 expressziót, és szerepet játszik-e a gazdaszervezet NLRP3 gyulladásos válaszának aktiválásában, a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin és a pcDNA3.1(+)-alfa A -7.3 giardint primer egér peritoneális makrofágokba transzfektáltuk rekombináns plazmid DNS-sel, és meghatároztuk az NLRP3 kulcsfontosságú gyulladásos fehérjék expressziójának, lokalizációjának és oligomerizációjának szintjét.Ebben a kísérletben a GEV-t használtuk pozitív kontrollcsoportként, és a kezelés nélküli csoport (csak PBS) vagy a pcDNA3.1(+) transzfekcióval kezelt csoport volt a negatív csoport.Az eredmények azt mutatták, hogy a GEV-csoporthoz hasonlóan a giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 és a giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 rekombináns plazmid DNS-e az NLRP3, a pro-IL-1β és a giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 növekedését eredményezte. prokaszpáz-1 és kaszpáz-1 aktiválása (2a. ábra).Ezenkívül mindkét giardin jelentős IL-1β szekréciót indukált (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (2b. ábra).A legtöbb ASC fehérje monomer volt a nem kezelt csoportban vagy a pcDNA3.1(+) plazmiddal transzfektált kezelt csoportban, ellentétben a pcDNA3.1(+)-alfa-2 vagy pcDNA3.1(+)-alfa- plazmiddal. 7.3 giardine.ASC oligomerizáció történt a GEV pozitív kontrollcsoport vagy csoport rekombináns plazmid DNS-ében, amely oligomer formát mutat (2c. ábra).Ezek az előzetes adatok azt sugallják, hogy az alfa-2 giardin és az alfa-7,3 giardin NLRP3 gyulladás aktiválást válthat ki.Az ASC és az NLRP3 lokalizációját vizsgáló későbbi immunfluoreszcens vizsgálatok azt mutatták, hogy a negatív kontrollcsoportban az ASC fehérje szétszóródott a citoplazmában, és pontjelként jelent meg a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinnal vagy pcDNA3-mal történő stimulálásakor.1(+)-alfa-7,3 giardin csoport vagy GEV pozitív kontrollcsoport (2d. ábra).A negatív kontroll és a plazmiddal kezelt pcDNA 3.1 csoportban az NLRP3 fehérje szignál nem volt kimutatható, míg a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinra vagy pcDNA3.1(+)-alpha-7.3-ra adott válaszként fluoreszcens szignál pont volt. észlelték..giardin található a citoplazmában vagy a HEV stimulálásakor (2e. ábra).Ezek az adatok továbbá azt mutatják, hogy a G. duodenalis giardin alfa-2 és giardin alfa-7.3 aktiválja az NLRP3 gyulladást egér primer peritoneális makrofágokban.
A pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin és a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin aktiválja az NLRP3 gyulladást egér peritoneális makrofágokban.Transzfektálja a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin és pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin rekombináns eukarióta expressziós plazmidokat primer rágcsáló peritoneális makrofágokba és sejtekbe, vagy gyűjtse be a felülúszót 24 órán belül az expresszió és az oligomerizáció elemzéséhez , váladék.és a kulcsfontosságú gyulladásos fehérjék lokalizációja.Negatív kontrollként a csak PBS-sel kezelt (C) csoportot és a pcDNA3.1(+) egyszeres kezelési csoportot, pozitívként pedig a GEV-kezelési csoportot használtuk.a kulcsfontosságú gyulladásos fehérjéket, az NLRP3-at, beleértve az NLRP3-at, a pro-IL-1β-t, a pro-kaszpáz-1-et és a p20 kaszpáz-1-et, Western-blottal detektáltuk.b Az IL-1β szekréció szintjét a felülúszókban enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) segítségével határoztuk meg.A kontroll és a kísérleti csoportok közötti különbségeket egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) elemeztük az SPSS szoftver 22.0 verziójával.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek a **P<0,01 és ***P<0,001 csoportok között.c A pelletek ASC oligomerizációs szintjét DSS keresztkötési analízissel határoztuk meg, míg a sejtlizátumok ASC szintjét terhelési kontrollként használtuk.d Az ISC lokalizáció megjelenítése immunfluoreszcenciával.e Immunfluoreszcenciát használtunk az NLRP3 lokalizációjának megjelenítésére.ASC, apoptotikus foltszerű fehérje;IL, interleukin;NLRP3, nukleotid-kötő oligomerizáció-szerű receptor 3;ns, nem szignifikáns (P > 0,05)
Mind a G. duodenalis, mind az általa szekretált GEV-k aktiválják az NLRP3 inflammaszómát és szabályozzák a gazdaszervezet gyulladásos válaszait in vitro.Így az NLRP3 inflammaszóma szerepe a G. duodenalis patogenitásában továbbra is tisztázatlan.Ennek a kérdésnek a vizsgálatára kísérletet terveztünk G. duodenalis cisztával fertőzött egerek és G. duodenalis cisztával + MCC950 inhibitor kezeléssel fertőzött egerek között, és összehasonlítottuk az NLRP3 gyulladásos expresszióját G. duodenalis cisztával fertőzött egerek között.A kísérlet részletes sémája a 3a. ábrán látható.A különböző kezelési csoportokban az egerek testtömegében bekövetkezett változásokat a cisztákkal való fertőzés után 7 napig követtük, és az eredményeket a 3b. ábra mutatja.A tiszta PBS-sel kezelt csoporthoz képest az eredmények azt mutatták, hogy (i) a G. duodenalis cisztával fertőzött egerek testtömege a fertőzést követő 3. napról 7. napra csökkent;(ii) az MCC950 inhibitorral végzett kezelésnek nem volt jelentős hatása az egerek testtömegére..Az egyetlen fertőzéses csoporthoz képest az MCC950-vel kezelt nyombélfertőzésben szenvedő csoport testtömeg-értéke különböző mértékben csökkent (1. nap: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2. nap: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001, 3. nap: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052, 5. nap; (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; 6. nap: ANOVA, F(3, 24) = 5,457, P = 0,0175; 7. nap: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202.Ezek az adatok azt mutatják, hogy az NLRP3 gyulladás megvédi az egereket a jelentős súlycsökkenéstől a nyombélfertőzés korai szakaszában (2-4 nap).Ezután a G. duodenalis trophozoiták kimutatására törekedtünk a nyombélmosó folyadékban, és az eredményeket a 3c. ábra mutatja.A G. duodenalis ciszta fertőzéses csoporthoz képest a duodenumban lévő trophozoiták száma szignifikánsan megnőtt az NLRP3 inflammaszóma blokkolása után (t(12) = 2,902, P = 0,0133).A HE-vel festett nyombélszövetek az önmagában PBS-sel és MCC950-nel kezelt negatív kontrollhoz képest: (i) A G. duodenalis ciszta fertőzés a nyombélbolyhok károsodását okozta (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P=0,0488 ) és kripta atrófia (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) G. duodenalis cisztákkal fertőzött és MCC950 inhibitorokkal kezelt egerekből származó duodenum.a nyombélbolyhok sérültek és elhaltak (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144), sorvadással és kriptaelágazásokkal (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (3d. ábra) f) .Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az NLRP3 gyulladás szerepet játszik a G. duodenalis patogenitásának csökkentésében.
Az NLRP3 gyulladás szerepe a Giardia duodenum fertőzésben.Az egereket duodenococcus cisztákkal szondáztattuk (iv), majd MCC950-el vagy anélkül kezeltük (ip).Kontrollként egyetlen PBS-sel vagy MCC950-nel kezelt csoportot használtunk.Kísérleti csoport és kezelési rend.b Az egerek testtömegét a különböző kezelési csoportokban 7 napon keresztül figyeltük.A G. duodenalis fertőzéses csoport és a G. duodenalis + MCC950 fertőzéses csoport közötti különbséget t-teszttel elemeztük az SPSS szoftver 22.0 verziójával.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek *P<0,05, **P<0,01 vagy ***P<0,001 esetén.c A parazita terhelést a duodenális mosófolyadékban lévő trophozoiták számának megszámlálásával határoztuk meg.A G. duodenalis fertőzéses csoport és a G. duodenalis + MCC950 fertőzéses csoport közötti különbséget t-teszttel elemeztük az SPSS szoftver 22.0 verziójával.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek, ha *P < 0,05.d Hematoxilin és eozin (H&E) festési eredmények duodenális szövettani vizsgálatban.A piros nyilak a bolyhok, a zöld nyilak a kripták sérülését jelzik.Skála: 100 µm.e, f A nyombélbolyhok magasságának és az egérkripta magasságának statisztikai elemzése.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek *P<0,05 és **P<0,01 értékeknél.Az eredmények 7 független biológiai kísérletből származnak.BW, testtömeg;ig, intragasztrikus bejuttatási út;ip, intraperitoneális bejuttatási mód;ns, nem szignifikáns (P > 0,05);PBS, foszfáttal pufferolt sóoldat;WT, vad típusú
Az IL-1β szekréciója a gyulladás aktiválásának egyik jellemzője.Annak meghatározására, hogy a G. duodenalis alfa-2 giardin és alfa-7.3 giardin aktiválja-e az NLRP3 gazdaszervezet gyulladásos sejtjeit in vivo, kezeletlen WT egereket (álcsoport) és NLRP3 gyulladással blokkolt egereket (MCC950 gátolt kezelési csoport) használtunk.A kísérlet részletes sémája a 4a. ábrán látható.A kísérleti csoportok PBS-sel kezelt egerekből, G. duodenalis ciszta szondán keresztül történő kezelésből, pcDNA3.1 intramuszkuláris injekcióból és pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin vagy pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin intramuszkuláris injekciójából álltak.A rekombináns plazmid intramuszkuláris beadását követő 7. napon szérumot gyűjtöttünk, és minden csoportban meghatároztuk az IL-1β szintjét.Amint a 4b. ábra mutatja, a MOCK csoportban: (i) a PBS csoporthoz képest a pcDNA3.1 kezelésnek nem volt szignifikáns hatása az IL-1β szekrécióra (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), azonban Az IL-β szekréció szignifikánsan megemelkedett a G. duodenalis ciszta csoportban (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2 giardin és pcDNA3.1. Az alfa-7,3 giardin intramuszkuláris injekciója szignifikánsan növelte a szérum IL-1β szintjét (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) A pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin magas szintű IL-1β szekréciót indukált a pcDNA3.1-alfa-2 giardin intramuszkuláris injekciós csoportjában (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Összehasonlítva az MCC950 kezelési csoport és a MOCK csoport mindegyik csoportjával: (i) Az IL-1β szekréció szintje a PBS kontrollcsoportban és a pcDNA3.1 kontrollcsoportban bizonyos mértékig csökkent az MCC950 inhibitor blokkolása után, de a különbség nem szignifikáns (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) az MCC950 blokkolása után., az IL-1β szekréció szignifikánsan csökkent a G. duodenalis cisztával fertőzött csoportban, a pcDNA3.1-alfa-2 giardin csoportban és a pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin csoportban (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-alfa-7,3 giardin (9, ANOVA5, 8); ) = 3,540, P = 0,0164).Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az alfa-2 giardin és az alfa-7.3 giardin közvetíti az NLRP3 gyulladásos aktiválódását in vivo.
A pcDNA3.1(+)-giardinek in vivo aktiválják az NLRP3 gazdaszervezet gyulladásos sejtjét.Az egereket immunizáltuk (IM) rekombináns eukarióta expressziós plazmiddal, a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardinnal vagy pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardinnal, majd MCC950-nel kezeltük (ip; MCC950 csoport) vagy nem (álcsoport) ).Negatív kontrollként a PBS vagy pcDNA3.1(+) plazmiddal kezelt csoportot, pozitív kontrollként a G. duodenalis cisztával kezelt csoportot használtuk.Kísérleti csoport és kezelési rend.b Az IL-1β szérumszintjét egerekben a 7. napon mértük ELISA vizsgálattal.A MOCK csoportban a csoportok közötti különbségeket egyutas ANOVA-val, a MOCK csoport és az MCC950 csoport közötti különbségeket pedig az SPSS szoftver 22.0 verziójának t-tesztjével elemeztük.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek a kezelési csoportok között a MOCK csoportban, *P<0,05 és ***P<0,001;dollárjelek ($) szignifikáns különbségeket jeleznek az egyes csoportok között a MOCK csoportban és az MCC950 csoportban P<0,05 értéknél.Hét független biológiai kísérlet eredménye.i, intramuszkuláris injekció, ns, nem szignifikáns (P > 0,05)
Az NLRP3 gazdagyulladás alfa-2 és alfa-7.3 giardin által közvetített aktiválásának G. duodenalis fertőzőképességre gyakorolt ​​hatásának vizsgálatára WT C57BL/6 egereket használtunk, és alfa-2 giardint és alfa-7.3 giardint injektáltunk.a plazmidot intramuszkulárisan injektáltuk, 3 nap elteltével a G. duodenalis ciszta gyomorszondáján keresztül, majd az egereket 7 napig megfigyeltük.A kísérlet részletes sémája az 5a. ábrán látható.Az egyes egerek testtömegét minden nap megmértük, a gyomorszondán keresztül történő beadást követő 7. napon friss nyombélszövetből mintát vettünk, megmértük a trofozoiták számát, és kórszövettani változásokat figyeltünk meg.Amint az 5b. ábrán látható, a táplálkozási idő növekedésével az egerek testtömege az egyes csoportokban fokozatosan nőtt.Az egerek MT értéke a G. duodenalis ciszták intragasztrikus beadását követő 3. napon kezdett csökkenni, majd fokozatosan emelkedett.Az alfa-2 giardin és alfa7.3 giardin intramuszkuláris injekciójával indukált NLRP3 gyulladás aktiválása szignifikánsan csökkentette egerek testsúlycsökkenését (1. nap: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 1. nap: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 2. nap: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 2. nap: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409 3. nap: pcDNA3.1-alfa-2 ANOVA, F,; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 3. nap: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 4. nap: pcDNA3,1-alfa-2VA-giardine , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, 4. nap: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, 5. nap: pcDNA3.1-alpha 2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 5. nap: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 6. nap: .1 -DNA alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, 6. nap: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;7. nap: pcDNA3.1-alfa-2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 7. nap: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).A parazita terhelést a duodenumban értékeltük (5c. ábra).A kezeletlen pozitív kontrollhoz és az üres pcDNA3.1 vektorral injektált csoporthoz képest a G. duodenalis trophozoiták száma szignifikánsan csökkent az α-2 giardinnal és α-7,3 giardinnal (pcDNA3.1-alpha) injektált csoportokban -2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Ezenkívül a giardin alfa-7,3 jobban védett egerekben, mint a giardin alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).A HE-festés eredményeit az 1. ábra mutatja.5d–f.Az alfa-2 giardinnal és alfa-7.3 giardinnal injektált egerekben kevesebb nyombélszöveti elváltozás volt, ami a boholyok károsodásában nyilvánult meg, összehasonlítva azokkal az egerekkel, amelyekbe G. duodenalis-t és G. duodenalis-t injektáltak üres pcDNA3 vektorral kombinálva.1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 vagy P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 vagy P = 0,0055) és csökkent kriptasorvadás (pcDNA3.1-alfa-2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 vagy P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-7,3 ANOVAgiardine , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 vagy P = 0,0191).Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az alfa-2-giardin és az alfa-7,3-giardin csökkenti a G. duodenalis fertőzőképességét az NLRP3 inflammaszóma in vivo aktiválásával.
A pcDNA3.1(+)-giardinok szerepe G. duodenalis fertőzésben.Az egereket immunizáltuk (IM) pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin vagy pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin rekombináns eukarióta expressziós plazmidokkal, majd G. duodenalis cisztákkal (ig) fertőztük.Negatív kontrollként a PBS-csoportot és a pcDNA3.1(+)+ nyombélcisztával kezelt csoportot, pozitív kontrollként pedig a nyombélcisztával kezelt csoportot használtuk.Kísérleti csoport és kezelési rend.b Az egerek MT-jét a különböző kezelési csoportokban a fertőzés után 7 napig monitoroztuk.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek a G. duodenalis csoport és a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin csoport csoportjai között, *P < 0,05, **P < 0,01 és ***P < 0,001;a dollárjel ($) szignifikáns különbséget jelez a G. duodenalis egyes csoportjai és a pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine csoport között, $$P<0.01 és $$$P<0.001.c A parazita terhelést úgy határoztuk meg, hogy megszámoltuk a trofozoiták számát 1 ml nyombélmosó folyadékban (3 cm hosszú), és a paraziták számát a duodenum cm-ére vonatkoztattuk.A G. duodenalis fertőzéses csoport, a pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin csoport és a pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardin csoport közötti különbségeket egyutas ANOVA-val elemeztük az SPSS szoftver 22.0 verziójával.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek **P<0,01 és ***P<0,001 értékeknél.d A duodenum hisztopatológiai elváltozásai.A piros nyilak a bolyhok, a zöld nyilak a kripták sérülését jelzik.Skála: 100 µm.e, f Egér nyombélbolyhok magasságának (e) és kriptamagasságának (f) statisztikai elemzése.Az 1d. ábrán látható csoportok közötti különbségeket egyutas ANOVA-val elemeztük az SPSS szoftver 22.0-s verziójával.A csillagok szignifikáns különbségeket jeleznek *P<0,05 és **P<0,01 értékeknél.Hét független biológiai kísérlet eredménye.ns, nem szignifikáns (P > 0,05)
A Giardia duodenum az emberek és más emlősök jól ismert bélparazitája, amely giardiasist okoz.2004-ben bekerült a WHO Elhanyagolt Betegségek Kezdeményezésébe, mivel 6 év óta magas volt, különösen az alacsony társadalmi-gazdasági státuszú közösségekben [32].A veleszületett immunrendszer kritikus szerepet játszik a G. duodenalis fertőzésre adott immunválaszban.Beszámoltak arról, hogy az egér makrofágjai extracelluláris csapdák felszabadításával elnyelik és elpusztítják a G. duodenalis-t [33].Korábbi vizsgálataink kimutatták, hogy a G. duodenalis, egy non-invazív extracelluláris parazita, aktiválja a p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 és NLRP3 gyulladásos jelátviteli útvonalakat egér makrofágokban, hogy szabályozza a gazdaszervezet gyulladásos válaszait, és a felszabaduló GEV fokozhatja ezt a folyamatot.13], 24].Azonban a pontos PAMP-ok, amelyek részt vesznek az NLRP3 gyulladás által szabályozott gyulladásban GEV-ben, és az NLRP3 gyulladásos szerepe a giardiasisban, még tisztázásra vár.Ennek a két kérdésnek a megvilágítása érdekében készítettük el ezt a tanulmányt.
Az NLRP3 inflammaszóma az immunsejtek citoplazmájában található, és különféle részecskék, például húgysavkristályok, toxinok, baktériumok, vírusok és paraziták aktiválhatják.Bakteriális vizsgálatok során a toxinokat kulcsfontosságú PAMP-ként azonosították, amelyek aktiválják a gyulladásos szenzorokat, ami gyulladáshoz és sejthalálhoz vezet [34].Egyes szerkezetileg változatos toxinok, mint például a Staphylococcus aureusból [35] és az Escherichia coliból [36] származó hemolizin, az enterotoxinból (NHE) [37] származó hemolizin BL (HBL) [37] az NLRP3 gyulladás aktiválását indukálják.Vírusvizsgálatok kimutatták, hogy a virulenciafehérjék, mint például a SARS-COV-2 burok (E) fehérje [38] és a Zika-vírus NS5 fehérje [39], az NLRP3 receptor által felismert fontos PAMP-ok.Parazitákkal végzett vizsgálatok során számos parazita összefüggésbe hozható a gazdaszervezet gyulladásos aktiválódásával, mint például a Toxoplasma gondii, a Trichomonas vaginalis [40], a Trypanosoma cruzi [41] és a Leishmania [42].A Toxoplasma gondii virulenciájához kapcsolódó, sűrű granulátum fehérjék, a GRA35, GRA42 és GRA43 szükségesek a piroptózis indukálásához Lewis patkány makrofágokban [43].Ezenkívül néhány Leishmania tanulmány az NLRP3 gyulladásban részt vevő egyedi molekulákra összpontosított, mint például a parazita membrán lipofoszfoglikán [44] vagy a cink metalloproteáz [45].Az annexinszerű alfa-giardin géncsalád közül az alfa-1 giardin potenciális vakcinajelöltnek bizonyult, amely védelmet nyújt a G. duodenalis ellen egérmodellben [18].Vizsgálatunkban a G. duodenalis virulenciafaktorait választottuk ki, az alfa-2 és alfa-7,3 giardinokat, amelyek egyedülállóak a giardiában, de viszonylag kevésbé jelentek meg.Ezt a két célgént a pcDNA3.1(+) eukarióta expressziós rendszer vektorba klónoztuk a gyulladás aktiválásának elemzésére.
Egérmodellünkben a hasított kaszpáz fragmentumok a gyulladásos aktiváció markereiként szolgálnak.Stimuláció hatására az NLRP3 kölcsönhatásba lép az ASC-vel, prokaspázokat toboroz, és aktív kaszpázokat hoz létre, amelyek a pro-IL-1β-t és pro-IL-18-at érett IL-1β-ra, illetve IL-18-ra hasítják.A gyulladásos kaszpázok (kaszpázok-1, -4, -5 és -11) a cisztein-proteázok konzervált családja, amelyek kritikusak a veleszületett védekezésben, és részt vesznek a gyulladásban és a programozott sejthalálban [46].A kaszpáz-1-et a kanonikus inflammaszómák aktiválják [47], míg a kaszpáz-4, -5 és -11 az atipikus gyulladások kialakulása során hasadnak [48].Ebben a vizsgálatban egér peritoneális makrofágokat használtunk modellként, és a p20 kaszpáz-1 hasított kaszpáz-1-et vizsgáltuk a gazdaszervezet NLRP3 gyulladás aktiválásának markereként G. duodenalis fertőzés vizsgálatában.Az eredmények azt mutatták, hogy sok alfa-giardin felelős a gyulladás tipikus aktiválásáért, ami összhangban van a baktériumokban és vírusokban szerepet játszó kulcsfontosságú virulencia molekulák felfedezésével.Vizsgálatunk azonban csak egy előzetes szűrés, és vannak más molekulák is, amelyek aktiválhatják a nem klasszikus gyulladásokat, mivel korábbi vizsgálatunk klasszikus és nem klasszikus gyulladásokat is talált a G. duodenalis fertőzésben [13].Annak további meghatározására, hogy a generált p20 kaszpáz-1 kapcsolatban áll-e az NLRP3 gyulladással, alfa-2 és alfa-7.3 giardinokat transzfektáltunk egér peritoneális makrofágokba, hogy meghatározzuk a kulcsfontosságú molekulafehérje expressziós szinteket és az ASC oligomerizációs szinteket, megerősítve, hogy mindkét α-giardin aktiválódik. gyulladásos NLRP3.Eredményeink kissé eltérnek Manko-Prykhoda és munkatársaitól, akik arról számoltak be, hogy a Caco-2 sejtek stimulálása G. muris vagy E. coli EPEC törzsekkel önmagában növelheti az NLRP3, ASC és kaszpáz-1 fluoreszcencia intenzitását. bár nem szignifikánsan, de a G. muris és az E. coli kostimulációja három fehérje szintjét növelte [49].Ez az eltérés a Giardia fajok, sejtvonalak és primer sejtek kiválasztásában mutatkozó különbségekből fakadhat.In vivo vizsgálatokat is végeztünk MCC950 használatával 5 hetes nőstény WT C57BL/6 egereken, amelyek érzékenyebbek a G. duodenalisra.Az MCC950 egy erős és szelektív kis molekulájú NLRP3 inhibitor, amely nanomoláris koncentrációban blokkolja a kanonikus és nem kanonikus NLRP3 aktivációt.Az MCC950 gátolja az NLRP3 aktivációt, de nem befolyásolja az AIM2, NLRC4 és NLRP1 gyulladásos útvonalak vagy a TLR jelátviteli útvonalak aktiválását [27].Az MCC950 blokkolja az NLRP3 aktiválását, de nem gátolja az NLRP3 iniciációt, a K+ kiáramlást, a Ca2+ beáramlást vagy az NLRP3 és az ASC közötti kölcsönhatást;ehelyett gátolja az NLRP3 gyulladásos aktivációját az ASC oligomerizáció blokkolásával [27].Ezért egy in vivo vizsgálatban MCC950-et használtunk az NLRP3 gyulladásos szerepének meghatározására giardin injekció után.Az aktivált kaszpáz-1 p10 a pro-IL-1β és pro-IL-18 pro-inflammatorikus citokineket érett IL-1β-ra és IL-18-ra hasítja [50].Ebben a vizsgálatban a giardinnal kezelt egerek szérum IL-1β szintjét MCC950-nel vagy anélkül használták annak indikátoraként, hogy az NLRP3 gyulladás aktiválódott-e.Ahogy az várható volt, az MCC950 kezelés jelentősen csökkentette a szérum IL-1β szintjét.Ezek az adatok egyértelműen bizonyítják, hogy a G. duodenalis giardin alfa-2 és a giardin alfa-7.3 képes aktiválni az NLRP3 egérgyulladást.
Az elmúlt évtized során felhalmozott jelentős adatok azt mutatták, hogy az IL-17A a G. muris elleni immunitás fő szabályozója, indukálja az IL-17RA jelátvitelt, antimikrobiális peptideket termel, és szabályozza a komplement aktivációt [51].Azonban a Giardia fertőzés gyakrabban fordul elő fiatal felnőtteknél, és arról számoltak be, hogy a fiatal egerekben a Giardia fertőzés nem aktiválja az IL-17A választ, hogy kifejtse védő hatását [52], ami arra készteti a kutatókat, hogy más immunmoduláló Giardia után nézzenek.A helminth fertőzés mechanizmusai.Egy közelmúltbeli tanulmány szerzői arról számoltak be, hogy a G. muris aktiválhatja az NLRP3 gyulladást az E. coli EPEC által, ami elősegíti az antimikrobiális peptidek termelődését, valamint csökkenti a kötődési kapacitását és a trofozoiták számát a bélrendszerben, ezáltal csökkentve a vastagbél súlyosságát. bacillusok okozta betegségek [49].Az NLRP3 gyulladás különböző betegségek kialakulásában vesz részt.Tanulmányok kimutatták, hogy a Pseudomonas aeruginosa autofágiát vált ki a makrofágokban, hogy elkerülje a sejthalált, és ez a folyamat az NLRP3 gyulladásos folyamat aktiválódásától függ [53].Az N. caninum esetében az NLRP3 gyulladásos reaktív oxigénfajták által közvetített aktiválása korlátozza replikációját a gazdaszervezetben, így potenciális terápiás célponttá válik [9].A Paracoccidioides brasiliensisről kimutatták, hogy egér csontvelő-eredetű dendritikus sejtekben az NLRP3 gyulladás aktiválódását idézi elő, ami az IL-1β gyulladásos citokin felszabadulását eredményezi, amely kritikus szerepet játszik a gazdaszervezet védelmében [10].Számos Leishmania faj, köztük a L. amazonensis, L. major, L. braziliensis és L. infantum chagasi, aktiválja az NLRP3-at és az ASC-függő kaszpáz-1-et a makrofágokban, valamint a Leishmania fertőzést.Az NLRP3/ASC/kaszpáz-1 gén hiányos egerekben a parazita replikációja fokozódik [11].Zamboni et al.A Leishmania fertőzésről beszámoltak arról, hogy aktiválja az NLRP3 gyulladást a makrofágokban, ami korlátozza az intracelluláris parazita replikációt.Így a Leishmania gátolhatja az NLRP3 aktiválását elkerülési stratégiaként.In vivo vizsgálatokban az NLRP3 inflammaszóma hozzájárult a Leishmania eliminációjához, de nem volt hatással a szövetekre [54].Ezzel szemben a helminthiasis vizsgálatokban az NLRP3 inflammaszóma aktiválása elnyomta a gazdaszervezet gastrointestinalis helminthiasis elleni védekező immunitását [12].A Shigella az egyik fő hasmenést okozó baktérium világszerte.Ezek a baktériumok indukálhatják az IL-1β termelést a P2X7 receptor által közvetített K+ kiáramláson, a reaktív oxigénfajtákon, a lizoszómális savasodáson és a mitokondriális károsodáson keresztül.Az NLRP3 inflammaszóma negatívan szabályozza a makrofágok fagocitózisát és baktericid aktivitását a Shigella ellen [55].A Plasmodium vizsgálatok kimutatták, hogy a Plasmodiummal fertőzött AIM2, NLRP3 vagy kaszpáz-1 hiányos egerek magas szintű 1-es típusú interferont termelnek, és ellenállóbbak a Plasmodium fertőzéssel szemben [56].Azonban az alfa-2-giardin és az alfa-7.3-giardin szerepe az NLRP3-gyulladás patogén aktiválásában egerekben nem világos.
Ebben a vizsgálatban az NLRP3 inflammaszóma MCC950 általi gátlása csökkentette a BW-t és növelte a trofozoiták számát az egerek bélmosófolyadékában, ami súlyosabb kóros elváltozásokat eredményezett a nyombélszövetben.Az alfa-2 giardin és az alfa-7.3 giardin aktiválja a gazdaegér NLRP3 gyulladását, növeli az egér testtömegét, csökkenti a trofozoiták számát a bélmosó folyadékban, és enyhíti a patológiás nyombélsérüléseket.Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a G. duodenalis képes aktiválni az NLRP3 gazdaszervezet gyulladását az alfa-2 giardinon és az alfa-7,3 giardinon keresztül, csökkentve a G. duodenalis patogenitását egerekben.
Eredményeink együttesen azt mutatják, hogy az alfa-2 és alfa-7.3 giardinok indukálják az NLRP3 gazdaszervezet gyulladásos folyamatát, és csökkentik a G. duodenalis fertőzőképességét egerekben.Ezért ezek a molekulák ígéretes célpontok a giardiasis megelőzésében.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: áttekintés.Nemrég kiderült, hogy Pat Inflamm allergiás a gyógyszerekre.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: a farmakoterápia áttekintése.Gyógyszerész szakértői véleménye.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, gyógyszerrezisztencia és új célpontok felfedezése.Megfertőzi a Disord gyógyszer célpontjait.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T stb. NLRP3 gyulladásos és gyulladásos betegségek.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. A gyulladás szerepe a bélgyulladásban és a rákban.Gasztroenterológia.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical and atypical NLRP3 inflammasome activation at the crossroads of immune tolerance and gut gyulladás.preimmunis.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S és mások.A ROS által közvetített NLRP3 gyulladásos aktiváció részt vesz az N. caninum fertőzésre adott válaszban.Parazita vektor.2020;13:449.